[发明专利]一种生物法合成异戊二烯的方法、酶系统和重组细胞及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生产异戊二烯化合物的领域，具体涉及一种利用生物法合成异戊二烯化合物的领域。

背景技术

异戊二烯又名2-甲基-1，3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，分子式C₅H₈。作为一种萜类化合物，异戊二烯为不溶于水的无色液体，但能与乙醇、乙醚、丙酮和苯等溶剂混溶。自身易聚合，也易与别的不饱和化合物共聚合。若在齐格勒-纳塔催化剂下聚合，则会产生聚异戊二烯，即天然橡胶成分，具有优秀的弹性、张力等。少量异戊二烯与异丁烯共聚，会产生丁基橡胶。

异戊二烯作为一种非常重要的合成单体，主要用于生产性能接近天然橡胶的聚异戊二烯橡胶，其用量占异戊二烯总产量的95％。其次，还可以用作合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能，异戊二烯还用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等。此外，还用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。

目前异戊二烯的生产主要通过化学法来进行，主要的合成路线有异戊烷，异戊烯脱氢法，异丁烯-甲醛法，乙炔-丙酮法，丙稀二聚法以及裂解C₅馏分萃取蒸馏法等(岳鹏，2006)。化学法生产异戊二烯的原料主要来源于石油基产品，具有不可再生性，且对环境具有较大的污染性。

因此，为这种有价值的化合物的生产提供更有效更绿色的方法将是本技术领域的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊二烯。目前已报道的异戊二烯生物合成途径都是通过生物体中存在的两种天然代谢途径，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径进行合成的，如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)；Genencor和Goodyear公司利用MVA途径在工程大肠杆菌中进行异戊二烯的生产，取得了最高60g/L的产量(美国专利公开，2009/0203102)。

目前通过MEP途径在工程蓝藻中进行异戊二烯的生物合成只能取得很低的产量，而在工程大肠杆菌中通过MVA途径进行异戊二烯的生产虽然取得了较高的产物浓度，但是该方法已经申请了专利保护，技术引进需要大量的资金，会使得生产企业产品成本过高，且缺乏核心竞争力，不利于企业长期的健康可持续发展。因此开发不同于以上两种代谢途径，具有我国自主知识产权的异戊二烯合成新方法，对于我们打破国外技术垄断，摆脱在异戊二烯生物合成领域的被动局面，提高我们在该领域的核心竞争力，促进我国异戊二烯生物合成工业走到健康的可持续的发展道路上来，具有十分重要的意义。

发明内容

本发明提供一种制备异戊二烯的新型方法，即从简单碳源，诸如葡萄糖的简单起始材料开始，在生物体内直接合成2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇，再将上述三种醇经过脱水后最终制备成异戊二烯的方法、酶和重组细胞。本发明利用亮氨酸的生物合成途径、亮氨酸降解途径以及甲羟戊酸脱羧途径，构建重组细胞并表达相应酶系统，进行2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇的生物合成。所述的酶系统、重组细胞和方法在制备异戊二烯中的应用；以及所制备的异戊二烯。所述的酶系统、重组细胞和方法在制备异戊二烯衍生物的应用。所述的酶系统、重组细胞、方法、异戊二烯、或者衍生物在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物例如：异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯—异戊二烯—苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂等。

一种合成3-甲基-1，3-丁二醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括氨基转移酶，烯酰-CoA水解酶和醇醛脱氢酶；所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。

一种合成3-甲基-3-丁烯-1-醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括HMG-CoA合成酶，HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸脱羧酶，所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。