[发明专利]鸡新城疫活疫苗的生产方法及其产品

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物疫苗的生产方法，尤其涉及鸡新城疫活疫苗的生产方法以及由该生产方法得到的鸡新城疫活疫苗，属于鸡新城疫活疫苗的生产领域。

背景技术

中国目前生产鸡新城疫低毒力活疫苗所用的是SPF鸡胚。目前国内SPF鸡胚的生产能力和质量状况制约畜禽生物制品的生产。用SPF鸡胚生产鸡新城疫活疫苗成本高，劳动利用率低，且易造成外源病毒污染，批间差异大，给疫苗产量、效力的提高带来困难。

此外，疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标，现有技术中对鸡新城疫疫苗效价的测定一直沿用SPF鸡胚法(EID₅₀)，用效价测定方法存在测毒不能准确定量，测毒结果易受鸡胚个体差异和培养条件影响，试验周期长、费时费力等缺陷，急需改进。

发明内容

本发明主要目的是克服现有的鸡新城疫活疫苗生产方法所存在的不足，提供一种利用细胞系生产鸡新城疫活疫苗的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种鸡新城疫活疫苗的生产方法，包括以下步骤：

(1)鸡胚培养的鸡新城疫弱毒接种传代细胞系，加入病毒生长液进行培养，得到细胞适应疫苗种毒；(2)将细胞适应疫苗种毒接种传代细胞系，加入病毒培养维持液进行培养，收获增殖病毒悬液；(3)测定增殖病毒悬液的毒价，将毒价检测合格的增殖病毒悬液进行配苗、分装及冻干，即得。

本发明首先将鸡新城疫弱毒La sota株接种不同传代细胞系，至37℃培养30～40小时，收获病毒液；将收获的病毒液继续传代，直至3～5代内出现细胞病变，筛选病毒可在哪些细胞系中增殖。实验结果显示新城疫弱毒疫苗株可在MDCK细胞系、vero细胞系，marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系或MDBK细胞系上进行增殖。

此外，本发明将不同鸡新城疫弱毒分别接种不同的传代细胞系，实验结果发现，能在MDCK细胞系、vero细胞系，marc-145细胞系、ST细胞系、BHK细胞系或MDBK细胞系上进行增殖的新城疫弱毒有La sota株，ZM10株、HB92株、CS2株、HB1株和B1株等新城疫弱毒株。

步骤(1)中，优选的，将鸡胚培养的鸡新城疫弱毒按感染复数0.01-0.5MOI接种单层传代细胞系，加入病毒生长液进行培养；其中，所述的培养包括：培养接种至70-100％(优选80-90％)的细胞发生病变时收获病毒液；收获的病毒液以同样的方法接种细胞，如此进行2-4代获得细胞适应疫苗种毒。

步骤(1)中所述病毒生长液的组成包括：94％-95％MEM液或DMEM液、5％-6％犊牛血清、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0-7.2。

优选的，步骤(2)中将细胞适应疫苗种毒按感染复数0.01-0.5MOI接种单层传代细胞系(更优选的，将细胞适应疫苗毒按感染复数0.1-0.5MOI接种单层传代细胞系)，加入病毒生长液，培养32～40小时，收获病毒液。其中，所述病毒培养维持液中的胰酶浓度优选为1.5-2.5ug/ml，更优选为2.0ug/ml。

步骤(2)中所述病毒培养维持液的组成包括：含0.05～3ug/ml胰酶的无血清MEM液或DMEM液、加适量的抗菌素，pH值调整为7.0～7.2。

步骤(3)中优选采用半数组织感染量(TCID₅₀)方法测定增殖病毒悬液的毒价；毒价合格的增殖病毒悬液每1ml含病毒≥10^7.0TCID₅₀；其中，所述半数组织感染量(TCID₅₀)测定方法包括：

a.准备细胞培养板：选取生长良好的上述细胞系，经胰酶-EDTA消化后，加入细胞生长液制备细胞悬液，调整细胞密度为1.5～3.5×10⁵个/ml，以100ul/孔接入96孔细胞培养板；

b.疫苗毒样品的稀释和接种：将要滴定的鸡新城疫疫苗病毒悬液用病毒生长液作10倍倍比稀释；将生长3天的96孔细胞培养板甩掉培养液，每孔加入200μl PBS，洗2次。每个细胞培养孔接入100μl样本，每个稀释度6～8个重复；

c.加入100μl培养基作为阴性对照，每块板至少设2列阴性对照；在37℃±1℃，4～6％CO₂培养箱中培养3～5天；

d.将96孔细胞培养板中液体每孔吸取25μl转移96孔v型血凝板，孔孔对应。在96孔v型血凝板每孔加25μl 0.5％鸡红细胞，室温作用20-25分钟；