[发明专利]一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学组织工程技术领域，尤其涉及一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法。

背景技术

先天性膀胱畸形包括膀胱外翻、发育不全，重复膀胱，脐尿管未闭，巨膀胱综合征及膀胱憩室，如膀胱外翻是由于胚胎期泄殖腔膜的发育异常，导致先天性的下腹壁和膀胱前壁缺损，膀胱后壁外翻，粘膜暴露的膀胱畸形，该病罕见，约1～4万新生儿中有一例，男性多于女性，约2～8∶1，由于膀胱外翻，膀胱粘膜和输尿管口外露，很易导致尿失禁及上行性的肾孟肾炎，未经治疗者半数死于儿童期。因此，先天性膀胱畸形患儿需要在出生后尽早对膀胱进行修补或重建。

目前，临床上膀胱修补或重建最常用的膀胱替代材料仍为胃肠道，但因其与泌尿系组织结构及生物特性不同而导致许多问题，如感染、代谢紊乱、尿结石形成、穿孔、黏液增多及恶性肿瘤形成等一系列并发症。于是，人们开展了用合成的生物材料替代膀胱壁的研究，目前修复重建膀胱的组织工程技术有两类：①未种植种子细胞技术，直接应用构建的细胞支架塑型和重建功能性膀胱，但多项研究表明，应用未种植种子细胞技术重建膀胱，移行上皮可以再生，肌层虽然可以出现，但常存在发育不良，并会随时间的延长出现瘢痕形成和移植物萎缩；②种植种子细胞技术，将体外扩增的种子细胞接种于细胞支架之上，而后移植体外构建的组织工程化组织入宿主体内继续生长，直至形成替代的膀胱组织。传统上膀胱组织工程中常用的种子细胞为膀胱移行上皮细胞和膀胱平滑肌细胞。在膀胱组织工程的研究早期，难以克服移行上皮细胞的老化问题，从Cilento等成功实现了移行上皮细胞在体外大规模扩增以来，原代培养基本形成了消化法、组织块法、刮取法和尿脱落细胞法等。但自体膀胱移行上皮和平滑肌细胞作为种子细胞的缺点：①当机体器官处于终末衰竭时，用于扩增足够细胞的组织标本可能无法获得，而且作为已分化成熟的细胞，在体外培养时，不仅增殖速度较慢，还存在去分化等问题；②由于染色体端粒的连续性缩短，正常的体细胞只能进行有限的分裂传代，如果达到传代的极限，细胞将衰老并死亡；③神经源性膀胱的平滑肌细胞在细胞增殖、收缩性及细胞黏附等方面都与正常细胞不同；④不适应于膀胱肿瘤患者。近几年，随着干细胞的不断深入研究，其独特的优越性展现在人们的面前。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特殊细胞。根据干细胞的来源、发育阶段、分化趋势可将它们分为两大类：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于存在伦理、来源、免疫排斥以及在条件不适时易成瘤性等问题限制了其的应用，而成体干细胞也存在细胞数量、免疫排斥等缺陷，且对于新生儿而言取材也很困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法。

为此，本发明提供了一种新生儿组织工程膀胱片，其特征在于其包含分化而来的平滑肌样细胞和可降解支架材料；包绕可降解支架材料，呈片状；所述平滑肌样细胞表达α-SMA、CALP和MHC。

在优选实施例中，所述干细胞为人羊水来源干细胞(human amniotic fluid colony-derived stem cells，hAFCSCs)、人羊膜间充质干细胞或脐带血间充质干细胞，其中最优选为自体hAFCSCs。hAFCSCs作为种子细胞构建组织工程膀胱迄今国内外尚无报道，且与胚胎干细胞，骨髓和脂肪等来源的间充质干细胞相比，还具有来源稳定易获取、无成瘤性、免疫原性弱、增殖和分化能力强等优势。

在优选实施例中，所述可降解支架材料为天然生物材料或人工合成可降解材料，其中天然生物材料为自然衍生材料或无细胞基质，自然衍生材料为纤维蛋白、胶原、透明质酸及其复合代物等大分子材料，无细胞基质有膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft，BAMG)、尿道细胞外基质(urethral extracellular matrix，UECM)或小肠黏膜下脱细胞基质(small intestinals ubmucosa，SIS)；所述人工合成可降解材料为聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸与聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-己内酯的共聚物(PLCL)、聚羟基链烷酸酯(PHA)或聚羟基丁酸(PHB)，其中优选聚羟基乙酸(PGA)。

另一方面，本发明还公开了一种新生儿组织工程膀胱片的制备方法，包括下列步骤：

将可降解支架材料置于培养容器中，干细胞悬液均匀地种到降解支架材料，37℃，95％湿度，5％CO₂的恒温培养箱中培养1-4小时；