[发明专利]一种HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，具体而言涉及HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

自然界大多数生物体的遗传信息均包含在脱氧核糖核酸(DNA)中，人类全基因组中30亿个碱基，约4万个基因，分布在24对染色体上。每个基因通过转录、翻译，编码特异的蛋白质，调控生物体内特定的生化反应，发挥特异的生物学功能。DNA序列的改变，即基因突变，会导致蛋白质结构、功能的改变或缺失，进而引起相关的遗传疾病。基因突变包括DNA分子中发生碱基对的插入、缺失和改变(点突变)。

研究表明许多疾病的发生，如血友病、地中海贫血、杜氏型肌营养不良、亨廷顿舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身免疫等3000多个疾病与基因突变密切相关。另外，近年来人们逐渐认识到癌症的发生发展也是基因累积突变的结果。

在人类基因组中，约90％的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的，主要由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样的差异位点称作单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)。在人群中，这种变异的发生频率至少要大于1％，否则被认为是点突变。SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式，并且在人类基因组中广泛存在，平均每500-1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。这些差异极有可能是造成个体差异的遗传因素，因此发现这些位点可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。

目前检测SNP和基因突变的方法有许多种，如直接PCR测序、RFLP、基因芯片和荧光定量PCR等。其中，RFLP分析只能检测出在病毒总体中大于5％的突变株，但是对于每个感兴趣的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶。针对某些突变的特异性内切酶可能并不存在，因此RFLP分析并不适用于所有的突变。基因芯片技术利用寡核苷酸微点阵，可以检测新发现的突变，但这种方法代价昂贵，没有得到广泛应用。总之，上述这些方法不是费时费力，灵敏度低，准确度低，就是成本高，不适合大规模筛查。

乙型肝炎病毒(HBV)及其基因

全球有超过350万人患有慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，每年由于感染HBV死亡的人数有50万到120万，而约有75％的乙肝患者在亚洲。我国是HBV感染高发区，因此对乙肝的治疗刻不容缓。

乙肝病毒是一种易高度变异的病毒，在其逆转录复制过程中因RNA聚合酶和逆转录酶缺乏校正功能，可发生一个或多个核苷酸的变异。HBV-DNA可以在慢性持续性感染过程中自然变异，也可以在免疫压力下发生变异，甚至在各种抗病毒治疗药物诱导下变异。近年来，核苷类药物已成为乙型肝炎治疗的主要方法之一，目前最常用的核苷类药物是拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ENT)、替比夫定(LdT)、恩曲他滨(FTC)和替诺福韦酯(TDF)。由于HBV病毒复制能力极强，因此也极易产生耐药，而一旦耐药可能会有爆发性肝炎的危险。因此对这六种核苷类药物耐药突变的检测应该有更加重要的临床意义。

HBV基因的核苷酸突变位点的测序检测

目前本领域中已有使用测序分析进行核苷酸突变位点检测的方法，但是在现有的方法中通常对低拷贝数的样品无法进行检测。因此，本领域中亟需新的检测HBV基因的核苷酸突变位点的方法，从而实现对HBV基因的多个核苷酸突变位点和突变型的灵敏、快速、简便并且成本低廉的检测。

发明内容

本发明的第一方面提供一种待测样本中HBV基因的核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤：

(1)针对HBV基因序列可能存在的突变位点在序列中的位置设计两对巢式PCR扩增引物，用所述第一对PCR扩增引物对待测样本中的DNA进行第一轮PCR扩增，然后再以第一轮PCR的扩增产物为模板，用所述第二对PCR扩增引物进行第二轮PCR扩增；

(2)对在步骤(1)中得到的扩增产物进行测序；

(3)对在步骤(2)中得到的测序结果进行数据分析，确定突变位点。

在一个优选实施方案中，

所述第一对PCR扩增引物为：

上游：5’-TCCTGCTGGTGGCTCCAGT-3’(SEQ ID NO：1)；

下游：5’-GCAACGGGGTAAAGGTTCA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述第二对PCR扩增引物为：