[发明专利]中性蛋白酶NPR表达和纯化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明涉及蛋白质的表达和纯化领域。

背景技术

HbAlc监测是糖尿病疗判定和调整治疗方案的“金标准”，而目前市场上常见的广泛应用于生化分析仪的酶法测定HbAlc的试剂盒得到了大量客户的认可。中性蛋白酶(NPR)作为测定HbAlc试剂盒中最重要的酶之一，其来源困难，价格昂贵，利用基因工程的手段将其进行表达，有着广泛的应用前景和良好的市场价值。

嗜热芽孢杆菌的NPR主要的表达方式有两种，一是利用枯草芽孢杆菌将其进行表达，二是利用NPR自身的启动子使得其在大肠杆菌进行表达。

目前有的关于中性蛋白酶NPR(Thermolysin)的表达，几乎都是利用杆菌自身发酵表达后再进行纯化，或者是利用枯草芽孢杆菌表达系统来进行表达，纯度可以达到很高的纯度，至少95％以上。

大肠杆菌表达系统由于其研究背景成熟、操作简单而且成本低，是表达外源基因的首选表达系统。但是，目前的研究表明杆菌的蛋白酶基因却无法在大肠杆菌中进行表达。究其原因，目前说法最多是中性蛋白酶基因对大肠杆菌有致死作用或是因为大肠杆菌不能转录枯草杆菌的促使生长调节基因。目前，已有利用利用pUC19载体、JM109菌株在大肠杆菌表达NPR蛋白的报道。根据已有的文献报道，两种方式表达NPR蛋白表达量低，最主要的是其纯化方面要先后用到疏水层析和亲和层析，工艺复杂而且会降低收率，限制了它的实用性。Kuniyo Inouye等人(Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli，and its purification and enzymatic characterization，Protein Expression and Purification 46(2006)248-255)描述了一种利用中性蛋白酶自身的启动子在大肠杆菌表达其基因序列的方法。然而，上述方法较难获得理想表达，并且获得的蛋白纯度较低(90％左右)。

因此，需要对中性蛋白酶NPR在大肠杆菌表达系统中表达的方法进行研究以找到能提高NPR表达量和简化其纯化工艺的方法。

发明内容

发明人发现对pET系列的载体进行修饰(去除pET系列的T7启动子)并表达中性蛋白酶的全长基因(而非开放阅读框)可获得良好的表达效果。

发明人发现1、在选择基因片段时，首选NPR基因的全长基因，而非开放阅读框(ORF)，从而在以后的表达中用到该基因自身的启动子；2、将NPR的全长基因克隆到常见的pET28b表达载体上，但除去pET28b载体上的T7启动子基因；3、将构建的重组表达载体转化Rosetta(DE3)表达菌株，增强含有稀有密码子基因的表达；4、保留pET28b多克隆位点3’端His标签，以利于表达的蛋白通过亲和镍柱实现纯化。

因此，本发明一方面提供一种中性蛋白酶的表达方法，该方法包括：

a)通过中性蛋白酶的全长基因与去除T7启动子活性的pET载体构建重组表达质粒，以及

b)通过步骤a)构建的重组表达质粒转化大肠杆菌，从而表达中性蛋白酶。

在本发明的方法中，优选的全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的方法中，优选的中性蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，本发明中使用的pET载体为pET28b。

优选地，构建重组表达质粒时保留pET载体3’端的His标签，去掉NPR基因的终止密码子。

优选地，本发明中使用的大肠杆菌为Rosetta(DE3)菌株。

在本发明的方法中，优选通过BglII和XhoI酶切位点构建重组表达质粒。

优选地，本发明的方法还包括对表达的中性蛋白酶进行纯化的步骤。

优选地，通过亲和镍柱对表达的中性蛋白酶进行纯化。

优选地，本发明的方法获得的中性蛋白酶纯度在95％以上。

本发明的方法可以广泛用于各个分子实验室进行表达，大大提高了蛋白的表达量及大大减少了NPR的纯化工艺，达到表达量高、纯化简单的效果。

附图说明

图1：pUC19-NPR转JM109后的表达情况，1：pUC19-NPR转JM109后上清；2：pUC19-NPR转JM109后沉淀；3：pUC19转JM109后上清；4：pUC19转JM109后沉淀；M：蛋白标记。