[发明专利]利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法，具体地说，涉及一种包括肠球菌分离纯化步骤、已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤和海洋水体粪便污染溯源分析步骤的利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法。

背景技术

粪便污染源示踪技术是利用不同动物粪便源本身所含有的示踪因子(化学物、微生物)的特异性，通过一系列实验技术针对水环境中的示踪因子的特异性加以检测识别以溯源的过程。该技术利用环境水体中的粪便污染指示菌来追踪宿主源，基因型(如脉冲场凝胶电泳法)和表型方法的应用尤其广泛。尽管基因方法重现性好，但因其高成本，操作复杂，对仪器设备要求高等特点不容易推广。表型方法中的抗生素抗性分析法只需基因型方法成本的一小部分，因操作简单、用时短、对指示细菌种群的要求低等优点而得到了广泛应用。抗生素抗性分析方法应用的理论基础是寄住于不同物种源肠道内的同种菌群因其生活的抗生素环境的不同，携带了带有其宿主特异性的抗生素抗性指纹，技术应用的关键首先要构建一个已知源指示细菌抗生素抗性指纹图谱库。

指示细菌的选择是粪便污染源示踪技术的基础和关键部分。肠球菌为革兰氏阳性需氧及兼性厌氧菌，是人和温血动物肠道内的长期寄住菌群，主要包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌等，多数能在含6.5％NaCl、40％胆盐、pH 9.6的介质中生长，与其他指示细菌(如大肠埃希氏菌)相比，具有对外界环境温度适应性强、抵抗力强及耐受性强、可以与多种抗生素相抵抗、生长营养要求不高等优点，相较于其他菌种更适合作为粪便污染指示细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用肠球菌抗生素抗性识别海洋水体粪便污染来源的方法，该方法包括：

肠球菌分离纯化步骤，在该步骤中，选择合适梯度体积的粪便样本，以带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36±1℃下培养2天后挑取符合肠球菌形态特征的菌落进行2～3次纯化，对经生化鉴定后确定为肠球菌的菌株进行保存；

已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤，在该步骤中，采用琼脂扩散法，以MH琼脂培养基为基质，检测肠球菌对10种常用抗生素的抗药性，以“1”表示抗药，“0”表示敏感表示各菌株的抗药表型，即各菌株的抗生素抗性指纹，构建已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，采用数据分析软件对图谱库进行判别分析；

海洋水体粪便污染溯源分析步骤，在该步骤中，采用数据分析软件，将从海洋水体样本中分离得到的未知源肠球菌的抗生素抗性指纹与已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库进行比对，依据相似性大小排序确定其最大可能来源，并据此对采样海域水体中的粪便污染进行溯源。

本发明提供的肠球菌分离纯化步骤包括：

1.选择合适梯度体积的粪便样本，以带栅格纤维滤膜和肠球菌选择性琼脂培养基为基质，在36±1℃条件下培养2天后挑取符合肠球菌形态特征的菌落进行2～3次纯化，对经生化鉴定后确定为肠球菌的菌株进行保存；

2.在肠球菌分离纯化步骤中，肠球菌生化鉴定要求对每株菌均需进行接触酶实验、10℃和45℃生长验证实验、耐高盐实验、耐高pH实验、牛奶中0.1％亚甲基蓝还原性实验共6种实验，对6种实验要求均完全满足的为肠球菌。

本发明提供的肠球菌分离纯化步骤可以大批量处理粪便样本，实现对肠球菌的快速分离与纯化。

本发明提供的已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤包括：

1.采用琼脂扩散法，以MH琼脂培养基为基质，检测肠球菌对10种常用抗生素的抗药性，以“1”表示抗药，“0”表示敏感表示各菌株的抗药表型，即各菌株的抗生素抗性指纹，构建已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，采用数据分析软件对图谱库进行判别分析。

2.图谱库建立方法选用的常用抗生素为青霉素G、四环素、利福平、万古霉素、红霉素、呋喃妥因、氯霉素、环丙沙星、磷霉素、高浓度庆大霉素共10种，本方法要求检测每株菌株对全部10种抗生素的抗药表型，并进行抗药性结果判读。

3.图谱库分析方法应用数据分析软件，采用判别分析法对图谱库进行分析，以源验证和交叉验证得到的平均正确归类率评估肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的归类准确性。

本发明提供的已知源肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立与分析步骤可用于大批量检测肠球菌的抗药性，能够满足对图谱库建立与分析的时效性与准确性要求，可以用于图谱库的快速建立与准确分析。

本发明提供的海洋水体粪便污染溯源分析步骤包括：