[发明专利]能拮抗促肾上腺皮质激素释放因子受体1的多肽及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质学和分子生物学领域，具体而言，本发明涉及一组能与促肾上腺皮质激素释放因子受体1(CRFR1)特异性结合并拮抗其功能的多肽及其用途。

背景技术

促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-Releasing Factor，CRF)是由41个氨基酸组成的神经肽，协调应激相关的自主神经、免疫、生理和行为反应，为参与机体应激反应的关键因子。CRF在体内分布广泛，下丘脑的室旁核、大脑、小脑、杏仁-海马复合体、肾上腺、腺垂体、胃肠道、胸腺、皮肤、胎盘及炎症细胞中都有较高的表达。CRF主要通过促肾上腺皮质激素释放因子受体(CRFR)介导生物学效应。CRFR是典型的G蛋白偶联受体，膜内的第3个环区是G蛋白的偶联区，主要通过AC-cAMP-PKA、PLC-IP3、DAG-PKC、ERK-MAPK等信号途径介导信号转导。CRFR主要有两种亚型，即CRFR1和CRFR2。大量研究证实，CRF-CRFR1信号途径与应激状态下内分泌、自主运动、行为改变以及内脏反应密切相关。

应激条件下，CRF由下丘脑室旁核释放，经垂体门脉系统到达垂体前叶，激活垂体前叶促皮质素细胞上的CRFR1，诱导促肾上腺皮质激素(ACTH)的分泌，ACTH进入体循环后促使肾上腺皮质分泌糖皮质激素，即通过激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)发挥其生理功能。正常情况下，HPA轴存在负反馈抑制，血浆中的糖皮质激素可通过海马、下丘脑、垂体上的糖皮质激素受体(GR)抑制过高的HPA轴活性，而长期处于应激环境的条件下，CRF分泌过多，GR受体功能低下，HPA轴负反馈遇到障碍，引起HPA轴活性过高，从而参与抑郁症等情感性疾病病理。临床研究证明，重度抑郁症患者HPA轴功能亢进，脑脊液中CRF水平过高，并通过CRFR1介导了HPA功能亢进和抑郁样行为。此外，CRFR1在许多人类肿瘤细胞中高表达，如人神经母细胞瘤，乳腺癌细胞，淋巴瘤细胞等。CRF及其相关肽通过CRFR1刺激肿瘤血管的生成，激活procaspase-3，最终促进肿瘤细胞生长，抑制肿瘤细胞凋亡。综上所述，CRFR1有望成为抗抑郁症和抗肿瘤治疗的新靶标。

近几十年来，多肽类药物以其独特的优势，如活性高、用药剂量小、毒副作用低(代谢终产物为氨基酸)，较小的肽几乎没有免疫原性等优点已引起科学界的高度重视。开发多肽类药物最经典和最有效的手段是噬菌体肽库展示技术。该技术是将外源DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上，使外源DNA片段与噬菌体的衣壳蛋白融合表达在噬菌体表面。利用靶分子采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能特异结合靶分子的目的噬菌体。目前该技术已广泛用于抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物开发等各个方面。这项技术通过“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选过程，可以将展示特异性外源肽的噬菌体从噬菌体肽库筛选出来，经扩增可以得到上千倍乃至10⁸倍的富集，从而可以很容易地对所筛选的克隆进行序列测定，最终确定表达的外源肽的氨基酸序列。

因此，利用噬菌体表面肽库筛选到新的CRFR1激动剂或拮抗剂具有重要的实用价值。

发明内容

本发明人利用噬菌体表面展示技术，通过表达、纯化CRFR1N端胞外区，得到纯化蛋白，然后以该蛋白为靶标，筛选环七肽库和十二肽库，令人意外地得到了7种与N端胞外区结合活性较高的多肽。基于上述实验，本发明人完成了本发明。

第一方面，本发明涉及具有促肾上腺皮质激素释放因子受体1结合活性的多肽或其药学上可接受的盐，其中所述多肽的氨基酸序列为WLPVDWH、NPAFELM、FWGDDGY、LLWLDWH、YLDAWENEVINF、DGYNGEPWIWQQ或YAGDFWDLDALA。

在该方面的一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列为DGYNGEPWIWQQ。

第二方面，本发明涉及一种融合肽，其可操作地连接有上述第一方面所述的一个或几个肽，其中所述肽可以相同或不相同。

第三方面，本发明涉及一种融合蛋白，其可操作地连接有上述第一方面所述的一个或几个肽，以及一种起靶向作用的蛋白或方便纯化的蛋白，其中所述肽可以相同或不相同。

第四方面，本发明涉及DNA或RNA序列，其编码上述第一方面任意一个实施方案所述的多肽。

第五方面，本发明涉及一种载体，其含有上述第四方面任意一个实施方案所述的DNA或RNA序列。