[发明专利]重金属胁迫下水稻总蛋白的双向凝胶电泳分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的分离纯化方法，尤其涉及一种重金属胁迫下水稻总蛋白的分离方法。

背景技术

重金属污染问题日益严重，目前我国污水灌溉及废弃物等对农田已造成大面积的土壤污染。汞是植物的非必需元素，是一种对生态环境和人类健康等有着巨大危害的环境污染物质，经过生物富集和食物链放大后将产生更加严重的后果(Rodriguez et al.，2003；Zhang and Wong，2007)。水稻作为主要农作物，在世界上一百二十个国家和地区广泛栽培种植，全球一半以上的人口以稻米为主食，但全球水稻平均亩产仅为二百公斤左右(中国新闻网，2009)。重金属污染的研究受到了人们的高度重视，粮食安全也成为当下全球共同关注的问题。

在长期的进化过程中，植物亦会相应产生多种抵抗重金属毒害的防御机制，在感受各种环境因子的信号后，基因表达便会发生变化，从而引起大量的蛋白质在种类和表达量上的变化(Baker，1987；Clemens，2001；Hall，2002)。生物与非生物胁迫下响应的基因与蛋白质的鉴定是了解植物对特定逆境下的适应机制及分子响应机制的最基本和最有利的工具，特别是突变体的蛋白质组是目前的热点(Ahsan et al.，2007)。近年来，水稻蛋白质组学的研究逐渐掀起热潮，已经与拟南芥的研究水平相持平(Agrawal et al.，2009)，有关环境胁迫下的水稻蛋白质组研究也在不断地开展，现有的报道主要集中在氧化胁迫，盐胁迫，磷、镉、铝胁迫等方面(Yan et al.，2005；Chitteti and Peng，2007；Takuya et al.，2007；Sang et al.，2008；Manju et al.，2009)。Yan等(2005)利用蛋白质组研究发现了水稻根6个新的盐胁迫响应蛋白：UDP葡萄焦磷酸化酶、根的谷氨酰胺合成酶、推测的新生肽结合蛋白复合物的α亚基、细胞色素C氧化酶6b-1亚基、推测的剪接因子类似蛋白和推测的肌动蛋白结合蛋白。Ashan等(2007)利用水稻根蛋白质组研究发现抗氧化相关蛋白和胁迫响应相关蛋白的诱导是铜胁迫下水稻自身建立的一个新的自我平衡。同时也通过砷胁迫下水稻根的比较蛋白质组学，开展了砷对水稻的伤害及水稻在代谢和防御机制上变化的研究，提出谷胱甘肽对于砷的解毒起到了关键作用(Ashan et al.，2008)。

水稻是蛋白质组学研究的模式植物，有很多学者对水稻蛋白的提取及电泳条件进行了多项优化，但主要集中在水稻叶片上，而关于汞胁迫下水稻根蛋白的提取则没有相关报道。众所周知，Hg²⁺处理水稻后其体内氧化水平和代谢水平将会发生明显变化，而且不同生长时期或不同器官的材料也存在差异，根中也本身就含有很多的次生代谢物质(如酚类物质)，对蛋白的提取、溶解和电泳分离会产生很大的影响(Canova et al.，2004)。

发明内容

本发明提供了一种重金属胁迫下水稻总蛋白的双向凝胶电泳分离方法，该方法通过对提取方法的优化，消除了杂质成分对凝胶电泳的影响，同时对双向凝胶电泳的参数进行优化，以得到清晰的图谱。

一种重金属胁迫下水稻总蛋白的分离方法，包括：

(a)提取水稻根蛋白粗品，用乙醚和乙醇的混合溶液洗涤，冷冻干燥后溶于裂解液，水浴加热0.5～2小时，离心，取上清液用丙酮沉淀，离心分离沉淀，冷冻干燥；

(b)将沉淀溶于增溶液中，用6～8倍体积的冷丙酮于-20～-15℃沉淀，离心分离沉淀，重复该步骤2～4次后，将沉淀冷冻干燥；

(c)将步骤(b)获得的沉淀溶于增溶液中，利用双向凝胶电泳分离。

所述的乙醚和乙醇的体积比为0.5～2。

所述的步骤(a)洗涤次数为2～4次。

所述的水浴加热温度为36～36.5℃。

所述的裂解液配方为：

5～7M尿素，1～3M硫脲，3～4％CHAPS，1％Pharmalyte pH3-10，3～5％PVP，35mM Tris，1～2％2-ME。

尿素和硫脲可以增加蛋白的溶解度，但是温度不能过高，否则尿素的降解会引起蛋白的氨基甲酰化而改变蛋白质的等电点，而且在36.5℃的水浴中不时震荡，可以使蛋白充分溶解。

所述的增溶液配方为：

3～4％CHAPS，1％Pharmalyte pH3-10，0.5～1.5％DTT。