[发明专利]柠檬酸及其盐类中耐热嗜酸菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于于柠檬酸中微生物检测技术领域，尤其涉及柠檬酸及其盐类中耐热嗜酸菌的检测方法。

背景技术

耐热嗜酸菌是科研人员在1984年从巴氏杀菌后的腐败苹果汁中分离出的一种耐热、耐酸、非致病、能形成芽孢的细菌。该菌可以在26～70℃温度范围pH2.6～6.0的条件下生长，它的孢子具有极强的抗热性，在较低的pH值时，工业巴氏杀菌后依然可以存活。它的芽胞以休眠的形式存活于浓缩果汁中，当果汁复水后，适宜的条件会使芽胞萌发、生长，从而导致果汁产品香气损失、口感变差、浊度升高、形成沉淀。

我国是柠檬酸及其盐类生产和出口大国，柠檬酸及其盐类中微生物的检测也越来越受到客户的关注。在柠檬酸生产过程中，因为柠檬酸具有较低的pH值，因此绝大多数的微生物都无法生存，只有很少的细菌、真菌有可能存活，耐热嗜酸菌就是其中的一类。由于生产条件所限，如果柠檬酸中存在耐热嗜酸菌，就会带入进一步加工的柠檬酸盐类产品中。而柠檬酸及盐类又是食品饮料行业常用的原材料之一，饮料行业为了保持风味口感等，一般采用巴氏灭菌，这种灭菌方法无法杀灭耐热嗜酸菌。如果饮料工厂使用了含有耐热嗜酸菌的柠檬酸及盐类，将会导致饮料产品香气损失、口感变差、浊度升高，甚至形成沉淀，严重影响产品的感官和质量。所以耐热嗜酸菌的检测和去除成为提高柠檬酸及盐类产品质量的一个重要课题。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了一种柠檬酸及其盐类中耐热嗜酸菌的检测方法。该技术方案操作程序简便，迅速，条件温和。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：柠檬酸及其盐类中耐热嗜酸菌的检测方法，包括下列步骤：

1.菌种分离

从柠檬酸钠废母液中经多次分离纯化培养得到耐热嗜酸菌菌株，菌落是不透明的、奶油或黄白色、乳黄色、微凸，在显微镜下，中间成杆状，末端有芽孢。菌落形态见图1，镜检图片见图2。用接种针挑取上述纯化培养得到的菌株接种到无菌蒸馏水中配成菌悬液，上摇瓶机振摇，作为试验样品；

2.样品处理

无菌操作移取试验样品10ml，在无菌容器中加入50mL灭菌蒸馏水稀释溶解，再无菌操作移取试验样品10 ml在另一相同容器中加入50mL灭菌蒸馏水稀释并且插入温度计控温；

3.加热处理

将溶解后的样品及对比控温样品置于水浴锅中，待控温样品溶液升至70℃时开始计时，保持70℃ 20min后迅速取出用室温水降至50℃；

4.膜过滤富集

在洁净试验台上安装好过滤装置，用直径50mm，孔径0.45μm水系滤膜真空抽滤，然后用100ml的灭菌蒸馏水冲洗样品容器和过滤器；

5.培养及计数

取下滤膜，附在预先准备好的YSG培养基表面，保证滤膜与培养基间接触不留气泡，将培养皿反转，置温度45℃，湿度48～52%培养箱内培养3～5d，3～5d后目测法观察，必要时用放大镜观察以免遗漏，记录滤膜上的菌落数，

即为10ml样品中嗜酸耐热菌的菌落数；

6.柠檬酸及盐类产品检测

将柠檬酸及盐类10g在盛有50ml灭菌蒸馏水的无菌容器中溶解，作为检查样品，同时用相同方法制备控温样品，将溶解后的样品及对比控温样品置于水浴锅中，待控温样品溶液升至70±1℃时开始计时，确保样品液的上液位应在水面下面，保持70±1℃ 20min后迅速取出用室温水降至50℃，其他步骤同上4～5。

所需材料

（1）试验试剂及用品

供检样品，1～2N无菌硫酸或盐酸、75%的酒精棉球、灭菌的蒸馏水、pH试纸、0.45um水系滤膜、BSSA琼脂培养基、PCA培养基、YSG培养基、酸化K氏培养基等。

（2）试验仪器

恒温培养箱（MJPS-150型）、高压灭菌锅（YXQG02型）、恒温水浴锅（HH-6 型）、微孔过滤器（津隆）、显微镜（XSP-4C型）、培养皿、吸管（1mL、10mL）、酒精灯、镊子、玻璃棒、温度计。量筒、三角瓶（1000ml、500ml）、玻塞三角瓶(150ml)、洗瓶、棉塞、牛皮纸、载玻片、接种针、称量纸、不锈钢药匙、火柴。

试验结果

同一培养基不同pH值对耐热嗜酸菌检测结果的影响：

分别调整YSG培养基的pH值为2.0～3.0，3.0～3.5，3.5～4.0， 4.0～5.0，5.0～6.0，6.0～7.0，7.0～8.0以相同的方法处理样品，分别在不同pH值的培养基上培养，结果见表1。

表1 不同pH值对耐热嗜酸菌检测结果的影响