[发明专利]防治大肠杆菌病的卵黄抗体及其制备方法和饲料添加剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种防治大肠杆菌病的卵黄抗体及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起，为对养禽业危害最为严重的疫病之一，目前，对大肠杆菌病的预防主要采用疫苗和抗菌药物。但大肠杆菌血清亚型众多，各血清型间的交叉免疫效果不佳，给疫苗和药物的预防带来一定困难。

大肠杆菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，可加快巨噬细胞对抗原的提呈作用，激活淋巴细胞的增殖反应，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫；大肠杆菌的菌毛蛋白也具有良好的免疫原性，给机体免疫后能产生相应的菌毛抗体，而且更为重要的是大肠杆菌的外膜蛋白和菌毛蛋白在不同血清型菌株间均具有交叉保护作用，能抵抗同源和异源菌株的攻击。两种蛋白在目前一些大肠杆菌病的防治中都具有重要的应用价值。

卵黄抗体(IgY)是禽类的一种免疫球蛋白，来源于血液，由卵泡选择性地将血液中的抗体主动转运到卵黄当中，具有IgG的典型构象，已广泛地用于畜禽病毒性和细菌性传染病的防控。实验证明卵黄抗体中的IgY浓度长期维持在相当于或高于血液浓度的水平，并且具有高度的稳定性，对热、酸、碱环境具有良好的耐受性。利用禽类规模化生产特异性免疫抗体，不仅成本低、特异性抗体效价高、安全性好，长期使用也不会使菌株产生耐药性，而且极为实用，易于推广，是一种安全、绿色、高效的新型生物制品。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以有效防治多血清型大肠杆菌病的卵黄抗体，该卵黄抗体是利用提取的禽致病性大肠杆菌O₇₈(Avian pathogenic Escherichia coliAPEC O₇₈)的外膜蛋白和菌毛蛋白混合液作为免疫抗原免疫鸡制备而成，此种卵黄抗体的免疫原性好，保护效率高，可针对多血清型的大肠杆菌，且无毒副作用，经济实用，易于推广。

本发明的另一目的是提供该卵黄抗体的制备方法和应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种防治大肠杆菌病的卵黄抗体，其特征在于：以禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白与菌毛蛋白混合液作为抗原，加入油佐剂免疫鸡制备而成。

其中，作为抗原的混合液中，禽致病性大肠杆菌O₇₈外膜蛋白与菌毛蛋白的体积比为1∶1。

本发明的卵黄抗体，抗原与油佐剂的体积比为1∶1～1.5。

其中，油佐剂由：白油94％(v/v)、司本-806％(v/v)和硬脂酸铝2％(g/v)组成。

本发明还提供了该防治大肠杆菌病的卵黄抗体的制备方法，其制备步骤如下：

(1)大肠杆菌外膜蛋白和菌毛蛋白的提取

将禽致病性大肠杆菌O₇₈划线接种于LB平板，37℃培养18小时，挑取单个菌落，接种3mL LB肉汤，37℃振荡培养15小时，然后取2mL LB培养液接种于200mL LB肉汤，继续培养15小时，收集菌液分别进行外膜蛋白和菌毛蛋白的提取，然后分别稀释至200-300μg/mL，-20℃保存备用；

(2)免疫用混合抗原的制备

将相同浓度的外膜蛋白与菌毛蛋白以体积比为1∶1混合均匀，然后按配比加入油佐剂，乳化分装备用；

(3)产蛋鸡的免疫

选用25周龄、大肠杆菌抗体阴性的健康经产蛋鸡，胸肌分点注射免疫制备的外膜蛋白和菌毛蛋白的混合抗原，免疫剂量为1.0mL/只，于首免后7天和14天时以同样剂量加强免疫，经3次免疫后7天收集鸡蛋，4℃保存备用；

(4)卵黄抗体的获取

采用水洗法从卵黄中提取卵黄抗体并进行透析纯化，然后以还原性和非还原性SDS-PAGE电泳检测其大小和纯度。

本发明的防治大肠杆菌病的卵黄抗体还可添加到食品、保健中或作为饲料添加剂添加到饲料中，或制备多血清型大肠杆菌病制剂，从而防治多血清型大肠杆菌病。

其中，本发明所采用的禽致病性大肠杆菌O₇₈(Avian pathogenic Escherichiacoli APEC O₇₈)购买自中国兽医药品监察所，也可以使用任何一株当前中国国内公开的大肠杆菌菌株，不同的禽致病性大肠杆菌O₇₈菌株不影响本发明的实施；制备卵黄抗体的过程中所使用的鸡可根据不同应用途径选择合适的鸡群，如用于治疗目的的卵黄抗体可以选用SPF鸡，预防性目的的卵黄抗体可以选用商品蛋鸡，也可以使用鸭等其他家禽。