[发明专利]TAFI含量的体外检测方法

权利要求书

1.一种TAFI含量的体外检测方法，其特征在于具体操作步骤如下：

步骤一采集人个体生物样品立即于30分钟内，4℃条件下离心取上清作为待检样品，置于冰盒1小时内使用或-20℃保存备用；

步骤二利用体外检测试剂盒，对待检样品进行TAFI含量测定；

所述体外检测试剂盒的内容物包括：捕获待检样品TAFI抗原并在固相上形成抗原抗体复合物的包被抗体的酶标板，用于稀释待检样品的样品稀释液，用于制作计算待检样品中的TAFI抗原含量的标准曲线的TAFI标准品，洗去未结合在酶标板上的分子的洗净液，用来使酶标抗体成比例的结合在抗原抗体复合物上的PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体及抗体稀释液，作为酶作用底物的30％过氧化氢和邻苯二胺及底物显色缓冲液，使底物显色反应停止的终止液；检测操作时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体用所述抗体稀释液300倍稀释，所述TAFI标准品加入1ml所述样品稀释液溶解，所述酶作用底物中各组分的用量比为：邻苯二胺13mg∶显色缓冲液体积13ml∶30％过氧化氢体积6.5μl；

步骤三利用所述样品稀释液对所述待检样品进行100-2000倍稀释；

步骤四取1ml样品稀释液溶解所述TAFI标准品，其浓度为48ng/ml，用所述样品稀释液对48ng/ml的标准溶液做2倍梯度稀释，制成浓度分别为24ng/ml，12ng/ml，6ng/ml，3ng/ml，1.5ng/ml，0.75ng/ml的标准工作液，以所述样品稀释液作为空白对照液；

步骤五分别取所述标准工作液、空白对照液、稀释的待检样品50μl，加入所述包被抗体的酶标板孔中，每个样品2个重复，室温静置1小时，所述待检样品中的TAFI抗原与包被在酶标板上的抗体特异结合，形成固相抗原抗体复合物；

步骤六弃去酶标板孔中的液体，拍干，加入所述试剂盒的洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中的未结合物质；

步骤七取所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体20μl，加入所述抗体稀释液6ml中，制成酶联抗体工作液；

步骤八向结合有抗原抗体复合物的所述包被抗体的酶标板孔中加入所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体50μl，室温静置1小时，所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体与所述固相抗原抗体复合物上的TAFI抗原结合；

步骤九弃去所述包被抗体的酶标板孔中的液体，拍干，加入所述洗净液300μl，静置10分钟，弃去拍干，重复3次，洗去所述包被抗体的酶标板孔中未结合的所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体，此时固相载体上带有的酶量与所述待检样品中受检抗原的量成正比；

步骤十取所述邻苯二胺1片，溶解于所述显色液13ml中，加入30％所述过氧化氢6.5μl混匀，制成所述酶作用底物；

步骤十一加入所述酶作用底物100μl，避光反应10分钟，固相上的酶催化所述酶作用底物成为淡黄色产物；

步骤十二加入所述终止液100μl终止反应，淡黄色产物立即转化为棕色，于492nm处测定吸光值；

步骤十三根据所述TAFI标准品的吸光值与浓度的关系，制作标准曲线，根据标准曲线计算所述待检样品中TAFI抗原的含量。

2.根据权利要求1所述的TAFI含量的体外检测方法，其特征在于：所述包被抗体和酶标抗体是针对重组人TAFI抗原所制备的鼠抗人单克隆抗体，所述鼠抗人单克隆抗体包含3B1和4E7，所述3B1为特异性结合TAFI和失活的TAFI，所述4E7仅与TAFI结合。

3.根据权利要求1所述的TAFI含量的体外检测方法，其特征在于：所述PAMAM标记的辣根过氧化物酶联抗体是由辣根过氧化物酶联抗体与带正电荷的PAMAM树突状多聚物混合，在室温条件下反应10～15分钟制成，二者的混合浓度为0.1～10∶1摩尔比。

4.根据权利要求1所述的TAFI含量的体外检测方法，其特征在于：所述包被抗体的酶标板的制备为，用磷酸盐缓冲液稀释抗体4E7至15μg/ml，每孔100μl包被酶标板，用含有10mM pH7.3的乙二胺四乙酸二钠溶液的1％明胶溶液作为封闭液，每孔200μl封闭酶标板。