[发明专利]一种番茄抗病毒蛋白基因的克隆

说明书

技术领域

抗病毒蛋白是植物细胞中的一种重要的免疫组分，其重要作用就是拮抗植物感染病毒的侵染，从植物组织和细胞中分离的抗病毒蛋白对于研发生物农药具有重要意义。本发明通过改进的DNA克隆技术和基因重组技术，将一种番茄抗病毒蛋白基因从野生秘鲁番茄（L.peruvianum）叶片中分离出来，其技术发明属于生物农药合成工程技术领域。

背景技术

抗病毒蛋白是植物细胞中的一种重要的免疫组分，其重要作用就是拮抗植物感染病毒的侵染，从植物组织和细胞中分离的抗病毒蛋白对于研发生物农药具有重要意义。

利用植物组织中已经合成的生物蛋白实现生物农药生产是现代农药应用与生物防治研究的重要研究课题。栽培植物及其农作物具有完备的防卫系统，能够抵御来自于微生物的侵染和危害。植物个体自身的生化反应过程产生了许多拮抗病原菌的化合物――各种蛋白、多肽、酯类、酚类的生化小分子，这些生化物质构成了植物的防卫反应系统。来自于植物自身的合成产物通常对人类和植物本身是没有危害的，也不会对人体产生负面的影响，是环境友好型的环保产品。因此，植物化合物生产是生物防治和药物生产的重要产业。

自从1986年诞生第一株抗病毒工程植株以来，植物抗病毒基因工程研究不论在深度上还是广度上都取得了很大的发展。来自于番茄的斑萎病毒抗性基因Sw-lp能够在植物组织内获得植物免疫系统的启动和抗性形状的表达，有助于植物自身免疫系统的激发和对斑萎病毒的抗病性。番茄的Sw-lp基因位于第9号染色体上，与分子标记CT 220有2.0cM，西班牙的科学家已经将番茄的两个BAC（ C09HBa0226D21 和C09HBa0109D11 ）测序，比对已经发表的Sw-5a和Sw-5b基因序列，我们利用野生的秘鲁番茄克隆了Sw-lp基因，该基因能够拮抗番茄斑萎病毒两个毒株（TSWV-A和TSWV-D）的侵染。Sw-lp基因全长为3738p，编码有1245氨基酸，是一个属于CC-NBS-LRR类型的抗病毒蛋白。

发明内容

本研究采用植物中存在的抗病毒蛋白基因进行重组抗病毒基因的克隆技术方法。这种抗病毒蛋白对自身基因转录与蛋白的合成不起破坏作用，但能特异失活与其基因互作的病毒蛋白，抑制病毒蛋白质的合成，使得浸染的病毒不能完成正常的侵染过程。大量的研究结果表明，植物体中的抗病毒蛋白具有专化型的病毒蛋白抑制作用。Sw-lp抗斑萎病毒蛋白基因是一种从中野生的秘鲁番茄（L.peruvianum）叶片中分离提取的基因，其编码蛋白是一种具有抗斑萎病毒侵染特性的抗病毒蛋白。本发明的目的是通过基因克隆技术和基因重组技术，从植物叶片中分离和克隆抗病毒蛋白，并且在原核中生物体中表达具有抗病毒特性的蛋白，实现有利于环境和人类健康的生物制剂和生物农药的应用。

本发明应用DNA重组技术和分子生物学方法，从野生番茄叶片中分离了一个长度为3738bp的抗斑萎病毒蛋白的基因Sw-lp，并在大肠杆菌中表达了这段目的基因。

本发明的是由以下技术方案实现的，1）从植物DNA中分离了一种抗斑萎病毒蛋白基因；2）在大肠杆菌中重组和表达了该基因。该基因片断的核苷酸序列为SEQ N0.1所示的长度从ATG到TGA为3738bp。该抗斑萎病毒蛋白的氨基酸序列为SEQ N0.2所示的长度1245个氨基酸。

所述的长度为3738bp的抗病毒蛋白基因Sw-lp，其插入到克隆载体pMD-18中时，获得了含有Sw-lp基因扩增片断的重组DNA质粒pMD-18 (lp）。质粒pMD-18 (lp）包含有长度为3738bp的抗病毒蛋白基因Sw-lp。该质粒经转化大肠杆菌（E.coli）DH5α获得克隆菌株pMD/Sw-lp，该菌株经过培养能够表达1245个氨基酸的抗斑萎病毒的蛋白，其菌种将在近期获得并补充保藏号。

本发明的技术特点：一是从野生秘鲁番茄叶片的DNA中分离出了抗病毒基因；二是所分离的抗病毒蛋白基因能够通过大肠杆菌表达；三是该基因克隆的方法是与基因重组技术相结合；四是该基因经过重组可以获得生物农药。