[发明专利]基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别是基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒。

背景技术

猪繁殖与呼吸道综合征（PRRS）以母猪流产、早产、产弱死仔胎等繁殖障碍，仔猪呼吸困难、高死亡率和育肥猪呼吸道症状为特征的一种严重传染病，是目前危害养猪业重要的病原之一，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV有抗体依赖性感染增强作用现象，临床可见接种PRRS疫苗后，猪群PRRS症状反而加剧，疫苗诱导机体产生的抗体增强了野毒在猪体内的复制。非结构蛋白是在病毒复制过程中产生的，只有机体处于病毒感染中才会产生，灭活苗免疫只产生相应的结构蛋白抗体。因此，若在不能区分PRRS灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群的情况下就对猪群进行免疫，则可能发生上述现象发生，从而造成经济损失。

发明内容

本发明的目的是：提供一种基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它具有较好的特异性、敏感性和可重复性，基本可以区分PRRS灭活疫苗免疫猪群和隐性感染猪群，为PRSS的临床诊断与预防控制提供参考依据。

本发明是这样实现的：基于PRRSV中Nsp10蛋白的ELISA试剂盒，它包括50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液及50~200μL终止液。

它包括50~200μL重组蛋白包被、50~200μL阳性对照、50~200μL 阴性对照、50~200μL封闭液、50~200μL酶标二抗、50~200μL底物液及50~200μL终止液。

它包括重组蛋白包被的浓度为0.922 μg/mL~59 μg/mL，阳性及阴性对照血清的稀释比例为1:10~1:320、酶标二抗的稀释度为1:500～1:2000（根据酶标二抗产品说明书进行稀释。）。

阳性对照为PRRSV分离毒注射于未免疫过的猪制备的阳性血清，阴阳性其临界值为0.32；阴性对照为未感染和未免猪繁殖与呼吸综合征疫苗的血清，稀释度为1:10～1:320。

血清稀释液为BSA的浓度为1g/100mL、脱脂乳的浓度为5g/100mL、明胶的浓度为1g/100mL或FBS的浓度为5g/100mL的溶液。

封闭液为BSA的浓度为1g/100mL、脱脂乳的浓度为5g/100mL、明胶的浓度为1g/100mL或FBS的浓度为5g/100mL的溶液。

底物液是邻苯二胺、四甲基联苯胺或杂环吖嗪。

终止液是浓度为1～2 mol/L的硫酸或浓度为10 mmol/L叠氮钠。

邻苯二胺（OPD）底物液的具体配方为：

显色底物溶液：在0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH5.0）中含20 mmol/L OPD和12 mmol/L H₂0₂，或10 mmol/L OPD和5.5mmol/L H₂0₂；终止液：2 mol/L硫酸（含0.1 mol/L亚硫酸钠）；测定波长：492nm。

四甲基联苯胺（TMB）底物液的具体配方为：

显色底物溶液：先将TMB以0.1 mol/L的浓度溶于二甲基亚砜，然后，再将其以1 mmol/L和H₂0₂以3.0 mmol/L的浓度溶于0.2mol/L醋酸钠/枸橼酸缓冲液（pH4.0），即可应用；终止液：2 mol/L硫酸；测定波长：450nm。

杂环吖嗪（ABTS）底物液的具体配方为：

显色底物溶液：先将ABTS以2 mmol/L和H₂0₂以2.5 mmol/L的浓度溶于0.1 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 4.2），即可应用；终止液：10 mmol/L叠氮钠；测定波长；414nm或405nm。

1、PRRSV Nsp10基因的诱导表达

将PRRSV中的Nsp10基因连接至pET-32a表达载体，将阳性重组表达质粒转入BL21(DE3)中，并接种于LB液体培养基(含50 μg/mL Amp)中，培养至OD₆₀₀值约为0.4～1.0时，加入IPTG至终浓度为l mmol/mL，30 ℃诱导培养5 h，离心收集菌体，用12%的聚丙烯凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图1。