[发明专利]一种人阴离子胰蛋白酶突变体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种人阴离子胰蛋白酶(人胰蛋白酶2)突变体。

背景技术

胰蛋白酶(Trypsin，EC3.4.21.4)在胰脏中以作为酶的前体胰蛋白酶原的形式被合成，并作为胰液的成分而分泌，受肠激酶的酶解或胰蛋白酶的自身激活成为活性胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在蛋白质测序中是重要的工具酶。

人体胰腺的分泌液包含两种主要的胰蛋白酶原形式，阳离子型(pI＞6.8)胰蛋白酶原-1和阴离子型(pI＜6.8)胰蛋白酶原-2。二者均由247个氨基酸组成，包括15个氨基酸的信号肽和8个氨基酸的活化肽。前者在胰腺内丰度最高，但自激活能力弱；后者丰度略低，但自激活能力很强。尽管这两个蛋白氨基酸序列的相似性高达89％，但是与胰蛋白酶抑制剂的反应具有一定的差异，并且表现出单克隆抗体结合的不同表位。

正是由于胰蛋白酶是活性强的肽链内切酶，可水解暴露在蛋白表面的赖氨酸和精氨酸残基的羧基端形成的肽键，包括其自身会自身水解。例如其存在N29I突变，将阻止其他分子接近胰蛋白酶的自溶位点，致使其不能自溶。而人胰蛋白酶-2与胰蛋白酶-1序列不同，第29位氨基酸就是Ile。

胰蛋白酶适应性广，在医药、轻工业及科学研究等方面都具有广泛的应用价值。胰蛋白酶可以作为蛋白水解酶类药物大量应用于医药行业中。它能够将变性蛋白水解成多肽或氨基酸，有效提高组织通透性，从而抑制浮肿及血栓周围的炎症反应，加快局部药液的扩散和吸收速率，而人体血清内含非特异性的胰蛋白酶抑制物，所以胰蛋白酶不会损伤正常组织，可大量用于溃疡、脓肿、血肿、炎症及坏死性创伤等辅助治疗。眼科上已经用于治疗各种眼部炎症、出血性眼病以及眼外伤等，用以促进瘀血、渗出液及坏死组织的消退，加快水肿和炎症的消失，缩短恢复期。

但由于天然酶的活性低、稳定性差，其应用受到了一定的局限。通过突变解决其稳定性的问题，同时提高其活性是一个非常好的方法，同时，可以克服其应用的局限性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具强的蛋白酶解能力的、稳定性提高的重组人阴离子胰蛋白酶突变体。

在本发明的第一方面，提供一种重组的人阴离子胰蛋白酶突变体，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2氨基酸序列的第122位由Arg突变为Leu。

在另一优选例中，所述的重组人阴离子胰蛋白酶突变体是：

(a)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白；或

(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸(如1-10个，较佳地1-5个，更佳地1-3个)且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白，且其氨基酸序列的第122位为Leu。

在另一优选例中，所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的适宜pH为6～11.5；更佳的pH为7～11；最佳的pH为10。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白。

在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的人阴离子胰蛋白酶突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的用途，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含所述的人阴离子胰蛋白酶突变体，以及与所述人阴离子胰蛋白酶突变体相容的载体(如水或缓冲液)。

在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于酶解蛋白质或变性蛋白质。