[发明专利]大豆根际土壤微生物群落宏基因组文库的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物学技术领域，具体涉及大豆根际土壤微生物群落宏基因组文库的构建及其应用。 

背景技术

由于培养条件和技术手段的限制，传统的微生物培养方法获得的微生物可能还不到自然界中实际微生物总数的1％。为了更真实全面地反应土壤微生物多样性情况及开发利用土壤中未可培养微生物资源，一种基于直接提取土壤微生物DNA并将其克隆到合适的载体再导入宿主菌中构建基因组文库的方法逐渐发展起来，这就是土壤宏基因组学。宏基因组学作为一种探索微生物多样性的强有力工具，经过十余年的发展，可以超越培养手段而直接获得新颖的生物催化剂和有价值的活性物质(Handelsman，2004，Microbiol Mol Biol Rev.；Streit et al.，2004，Curr Opin Biotechnol.；Schmeisser et al.，2007，Appl Microbiol Biotechnol.)。宏基因组文库促使人们将目光转向微生物群落和功能研究上，为未培养微生物遗传信息的研究提供方法和手段，并用以解决医学、农业和工业上的问题。

宏基因组决定了生物群体的生命现象，包含了远比可培养的微生物类群更海量的遗传信息。国外已有很多从不同环境样品的宏基因文库中通过功能性筛选获得新的抗生素、脂肪酶、几丁质酶、蛋白酶、DNA连接酶、膜蛋白、4-羟基丁酸脱氢酶等合成基因或基因簇，以及对群落结构组成和功能进行分析的报道(Henne et al.，1999，Appl Environ Microbiol.；Entcheva etal.，2001，Appl Environ Microbiol.；Beja et al.，2002，Appl Environ Microbiol.；Rolf Daniel，2005，Nature；Yun et al.，2004，Appl Environ Microbiol.；Pathak et al.，2009，Environ Microbiol.)。国内也逐步开展起相关研究(Liu et al.，2009，Appl Microbiol Biotechnol.)。 

微生物生态学研究为更好的认识环境中微生物群落结构、变化以及微生物在其中的活动提供了理论依据，而分子生物学方法的引入让我们能更充分了解土壤中的微生物群落。而这些方法的共同基础，是从土壤中提取大量不含抑制物并且具有典型群落代表性的微生物总DNA，这也是宏基因组文库构建过程中至为关键的第一步。因此需要尽可能地使所提取的基因组DNA具有代表性，保持较大片段以增加获得完整的目的基因或基因簇的可能，还要达到较高的纯度以增加建库效率。为了达到这些要求，很多实验室致力于摸索DNA提取的最佳条件，也有研究者将环境样品经过有针对性地富集后再进行DNA提取，但富集培养极可能会导致样品中微生物多样性的降低。通过设计根际箱系统获得根际土壤可用于提取土壤总DNA，但仍然难以完全排除根毛对微生物基因组DNA的影响。而采用一种以Nycodenz为介质的高速 密度梯度离心法，来回收和纯化细菌细胞(Bertrand，et al.，2005，J Microbiol.；Amalfitano，et al.，2008，J Micobiol Meth.)则可获得高纯度的土壤微生物DNA。这种“间接”的方法更适合提取未降解的DNA，因为细菌团处于Nycodenz介质中从而限制了DNA和土壤组分的接触，对于去除粘性土壤中腐植酸和金属离子等效果显著。虽然操作难度和成本较高，但可以得到浓度和纯度很高，片段较大的基因组DNA，为后续的酶切操作和构建高质量的文库奠定了很好的基础。 

大豆作为一种重要的油料农作物，为我国食物的主要植物蛋白来源，同时又是具高效“固氮作用”可用于改良土壤的植物。通过构建大豆根际微生物宏基组文库，有助于比较完整地阐述根际微生物群落的多种特征。通过随机挑取克隆并进行序列测定，来鉴定和表征根际范围内微生物所有存在的基因，从而了解不可培养微生物新的代谢途径、基因调控因素、未知功能基因及对病原物具有抗性的基因等。因此通过构建根际土壤宏基因组文库并对部分克隆进行测序，有助于明确根际微生物群落(包括固氮菌群)结构、遗传、功能多样性，深入探讨其在改善土壤营养状况中的作用机制，对于完整揭示整个土壤微生物群落的生态过程和功能具有重要的应用价值。 

发明内容

本发明需要解决的问题是构建一个能够反映大豆根际微生物群落原位生态的宏基因组文库及获得新的基因序列。