[发明专利]基于分子生物学方法的天然气微生物勘探方法

权利要求书

1.基于分子生物学方法的天然气微生物勘探方法，其特征是，该方法通过检测勘探地的土壤样品的特异性指示菌勘探天然气，检测到所述特异性指示菌表示所述勘探地具有天然气，所述土壤样品的取样深度为0.5～2.5m，所述特异性指示菌为甲基孢囊菌属。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述土壤样品的取样深度为1～1.5m。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述检测特异性指示菌的方法包括以下步骤：

1)取样：取所述土壤样品；

2)设计甲烷氧化菌特异性扩增引物；

3)提取所述土壤样品的总DNA；

4)建立甲烷氧化菌功能基因pmoA克隆文库；

5)分析所述土壤样品的甲烷氧化功能菌，确定是否含有甲基孢囊菌属。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，步骤1)中采取所述土壤样品的方法为：线状或环状取土壤样品3-5个，每个取样点相隔150-200米。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征是，步骤2)中所述甲烷氧化菌特异性引物为颗粒单加氧酶基因PMMO。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，步骤3)中提取所述土壤样品的总DNA的方法为：将所述土壤样品碾碎充分混匀，每个样品秤取0.4～0.6g的等量样品2～4份，按FastDNASpin Kit for Soil试剂盒说明提取样品总DNA，将每个样品的2～4份DNA混合到一起。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征是，步骤4)中建立甲烷氧化菌功能基因pmoA克隆文库的方法包括：

(1)甲烷氧化菌功能基因pmoA扩增：扩增甲烷氧化菌功能基因pmoA引物为A189和mb661，A189的序列为5′-GGNGACTGGGACTTCTGG-3′，mb661的序列为5′-CCGGMGCAACGTCYTTACC-3′，通过Touchdown PCR程序来实现对甲烷氧化菌功能基因pmoA的扩增；

(2)克隆建库：对甲烷氧化菌功能基因pmoA扩增产物进行扩增片断的割胶纯化，然后进行连接转化和验证阳性克隆，阳性克隆再进行内切酶分析分型，将两种酶切图谱相同的克隆归为一种发育类型；

(3)库容饱和度分析：应用Rarefaction分析软件对克隆文库的库容饱和度进行分析，以检测建立的克隆文库是否已经足够全面地代表了MOB群落的多样性。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征是，步骤5)中，分析所述土壤样品的甲烷氧化功能菌是通过测序和构建系统发育树进行的，包括：测序所得序列通过DNAMAN软件进行处理，处理后的序列在NCBI数据库中比对分析，寻找亲缘关系最近的序列用DNAMAN软件构建系统发育树。