[发明专利]整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因重组领域，特别涉及缺陷型慢病毒在介导锌指核酸酶于动物早期胚胎表达中的应用。

背景技术

基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一,特别是在遗传修饰疾病动物模型制备等方面,基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。传统的动物基因组靶向修饰方法为DNA同源重组法，其不仅效率低,而且不适宜于除小鼠以外的其它哺乳类模式动物种属,从而限制这些技术的应用。

    锌指核酸酶(ZFN) 的出现,给基因组靶向修饰技术带来了希望。锌指核酸酶

能识别特异的DNA 序列,并在此特异位点产生一个DNA 双链切口,而后细胞固有的DNA 修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复,从而达到DNA靶向修饰的目的。锌指核酸酶技术不仅将基因组靶向修饰的效率提高了3～5 个数量级,而且具有极高的特异性。利用ZFN 对动物基因组靶向修饰,能够缩短动物良新品种的培育时间。但利用ZFN创制转基因或基因敲出动物新品种，要求ZFN在动物早期胚胎暂时性表达的时间较长。现有技术中，ZFN于动物早期胚胎表达的技术通常为：向动物胚胎胞质或胞核注射编码ZFN的mRNA，或向动物胚胎原核注射编码ZFN的质粒DNA。但由于mRNA极易降解，只能实现ZFN于动物早期胚胎短暂表达，不利于ZFN活性充分发挥进而对动物早期胚胎基因组进行高效的位点特异性遗传修饰。虽然向早期胚胎细胞原核导入质粒DNA可实现ZFN较长时间的暂时性表达，但该方法要求动物胚胎原核清晰，不适合除小鼠以外的其它哺乳类动物种属。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供整合缺陷型慢病毒的新应用，该应用可以延长ZEN动物早期胚胎的表达时间，为实现上述目的，本发明的技术方案为：

整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用及方法。

上述应用中，首建构建表达锌指核酸酶的重组慢病毒载体；之后利用整合酶功能缺失的包装质粒包装表达锌指核酸酶的重组慢病毒载体，获得表达锌指核酸酶的整合缺陷型重组慢病毒；通过卵周隙显微注射或共孵育等方式利用整合缺陷型慢病毒感染感染动物早期胚胎，实现锌指核酸酶于动物早期胚胎的表达。

本发明的另一目的在于提供延长锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的方法，方法能显著延长ZEN于动物早期胚胎的表达时间。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

延长锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的方法，将缺陷型慢病毒用卵周隙显微注射感染动物早期胚胎，所述缺陷型慢病毒为表达锌指核酸酶的整合缺陷慢病毒表达载体。

 

本发明的有益效果在于：1、与向胚胎胞质或胞核注射mRNA相比，本发明显著延长ZFN于动物早期胚胎的表达时间。体外检测表明，mRNA注射法表达时间为3～4天,本发明表达时间在7天以上。2、与向动物早期胚胎原核导入质粒DNA的方法相比，本发明可适用于除小鼠以外的其它种属哺乳动物，如大鼠、猪、羊、牛等。

 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1  整合缺陷型慢病毒在介导锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的应用及方法

1、通过DNA重组将编码ZFN的基因序列亚克隆至慢病毒载体，获得表达ZFN的重组慢病毒载体。

(1)利用BamHI和EcoRI内切酶双酶切质粒pST1374（左向锌指核酸酶）或pCDNA3.1（右向锌指核酸酶），切下包含有锌指核酸酶开放阅读框（ORF）的DNA片段；

(2)通过凝胶电泳使锌指核酸酶编码区DNA片段和质粒DNA片段分离，通过凝胶纯化回收锌指核酸酶编码区片段（操作见所用的商业化试剂盒说明书）；

(3)利用相同的核酸内切酶双酶切慢病毒载体FUW，并通过凝胶电泳按照步骤（2）回收、纯化酶切后线性化的慢病毒载体；

（4）将纯化的锌指核酸酶编码区片段和酶切后线性化的慢病毒载体，按照分子数量之比3：1的比例混合，利用T4 DNA连接酶连接；

（5）将步骤（4）的连接反应产物转化至感受态细菌DH5α，通过筛选培养获得抗性克隆，即为含有表达锌指核酸酶的重组慢病毒载体的转化细菌。

2、利用质粒抽提试剂盒分别提取ZFN慢病毒表达载体质粒、表达包膜蛋白VSV-G的包装质粒和表达病毒结构蛋白和缺陷型整合酶的包装质粒，浓度为400μg/mL。