[发明专利]一种水产中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测水产中硝基呋喃类代谢物的快速检测方法，具体涉及一种检测水产中呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的快速检测方法。

背景技术

硝基呋喃类药物是一类人工合成的抗菌药物，主要指呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林以及呋喃它酮。硝基呋喃类药物对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用，而且价格低、药效好，曾经在水产养殖业中广泛使用。大剂量或长时间使用硝基呋喃类药物均能对养殖动物产生毒性作用和“三致”作用。“三致”作用指致癌、致畸、致突变作用。硝基呋喃类化合物是直接致变剂，它不用附加外源性激活系统就可以引起细菌的突变。呋喃它酮为强致癌性药物，呋喃唑酮具中等强度致癌性。高剂量饲喂食用鱼和观赏鱼，可诱导鱼的肝脏发生肿瘤。繁殖毒性结果表明，呋喃唑酮能减少精子的数量和胚胎的成活率。当含有硝基呋喃类抗生素残留的水产品为人所食用后，这些代谢物就可以在胃酸作用下从蛋白质中释放而被人体吸收，造成严重危害。硝基呋喃类药物在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成为结合态，可长期保持稳定。所以在食品安全的检测中主要是检测硝基呋喃代谢物。

近几年因为硝基呋喃类药物残留超标阻碍我国水产品出口贸易的事例屡见报道。2002年3月，欧盟以从我国进口的某些水产品测出呋喃西林等硝基呋喃类药物残留为原由，开始全面停止进口我国动物源性产品。造成大量产品积压和企业停产。2005年11月，日本对中国大陆和台湾省的烤鳗分别检测出硝基呋喃类代谢产物AOZ超标。2006年2月，宁波慈溪某进出口公司的27.5t冻烤鳗由于被检出硝基呋喃类代谢产物AOZ超标，被日本方面全部退回，损失达54.6万美元。

鉴于硝基呋喃类药物残留的严重危害，欧盟已于1995年禁止在食用物中使用，并决定自2002年3月开始对进口的食品类产品进行此类药物的现场检测。2003年欧盟委员会通过决议，确定水产品中硝基呋喃类药物及代谢物的限值为不得检出。我国农业部也于2002年4月发布193号公告，公布了《食品动物禁用兽药及其他化合物清单》，规定硝基呋喃类抗生素在所有食品动物中禁止使用，2003年又将水产品硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划。

目前用于检测此类药物及其代谢物残留的方法主要有：高效液相色谱法及其联用技术、分光光度法、免疫分析法等。

高效液相色谱法及其联用技术是目前国内测定硝基呋喃类代谢物使用最多、也是比较权威的方法，灵敏度高、精度高。但该法的样品前处理相对复杂，检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多、操作时需要专门的技术人员，难以满足现代检测快速、简捷、现场化的要求。

分光光度法可以判定水产品中是否存在硝基呋喃类代谢物，且不需昂贵的仪器与试剂，样品前处理操作简单，有较好的推广及应用价值，缺点是测定结果准确度较低。

酶联免疫吸附法是应用抗原抗体特异性反应和酶的高效催化作用来测定硝基呋喃类代谢物的免疫分析方法，具有特异性高、灵敏度高、快速、简便等优点。但是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，由此易造成测定结果重复性较差。此外ELISA试剂寿命短，因此需要低温保藏。

发明内容

本发明针对水产中的硝基呋喃类代谢物残留展开研究，提供一种用于现场快速筛选水产中呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的方法，制备检测呋喃唑酮代谢物、呋喃妥因代谢物、呋喃西林代谢物以及呋喃它酮代谢物的免疫胶体金快速检测试剂板。本发明试剂板操作简单便捷，灵敏度高，实验结果肉眼可直观判断，无需配备仪器设备，检测既可在实验室中进行，也可在野外、水产市场等地方进行，5-10min完成对样品中硝基呋喃类代谢物的定性和半定量测定。

本发明制备一种免疫胶体金快速检测试剂板，试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1-2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

胶体金结合垫上包被有抗硝基呋喃类代谢物单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有硝基呋喃类代谢物-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。偶联硝基呋喃类代谢物的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。