[发明专利]环肽YM-216391的生物合成基因簇

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及具有抗肿瘤活性的环肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

环肽YM-216391(1，图1)由高贵链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274所产生，是2005年由日本科学家K.Sohda等在寻找新的抗癌药物的过程中发现的新型环肽类化合物，它具有良好的抗肿瘤活性[J.Antibiot.(2005)58，27-31；J.Antibiot.(2005)58，32-36]。环肽YM-216391具有独特的化学结构，包含2，4-连接的4个噁唑环和1个噻唑环，其两端由D-allo-异亮氨酸残基-L-缬氨酸残基-甘氨酸残基组成的三肽连接并成环，该结构与受到科学家广泛关注的端粒酶抑制剂Telomestatin(2，图1)以及同样具有抗肿瘤活性的IB-01211(3，图1)、Urukthapelstatin A(4，图1)的结构非常相似。

体外实验显示环肽YM-216391对人宫颈癌HeLa S3细胞生长具有很强的抑制活性，其细胞生长半数抑制剂量IC₅₀值仅为14nM。对39种肿瘤细胞系的体外筛选实验初步表明，YM-216391可能导致肿瘤细胞的凋亡；同时通过与其他标准抗肿瘤药物的对比分析显示，YM-216391与其他抗肿瘤药物的活性谱没有特别明显的相关性，因而不能由此推测可能的作用靶标或机制。而其活性谱与RNA聚合酶抑制剂Actinomycin D、蒽环类抗肿瘤药物Epirubicin以及组蛋白脱乙酰化酶抑制剂FR901228有一定相关性，然而体外生化实验表明即使在10μM的浓度下(高于IC₅₀值500～1000倍)，YM-216391对组蛋白脱乙酰化酶仍然没有任何抑制作用。此外，YM-216391与Telomestatin结构类似，Telomestatin是很强的端粒酶抑制剂(IC₅₀为5nM)，然而对于很多肿瘤细胞的生长抑制活性YM-216391却比Telomestatin高50～250倍，因此两者是否具有不同的机制尚不清楚[J.Antibiot.(2005)58，27-31]。关于环肽YM-216391的抗肿瘤活性的更深入的药理学、作用机制以及构效关系研究正在进行中。

含噻唑啉和噻唑环的化合物除了具有明显的生物学活性外，进一步的研究表明它们能通过氢键或配位作用与小分子或者金属离子相结合。化学合成的含噻唑啉-噻唑环结构的手性大环分子与Pb²⁺和Cd²⁺具有较强的亲和能力，并且在金属离子的选择上有高度的特异性，这在环境污染的检测和治理上有很大的应用潜力[Chem.Commun.(2007)10，3444-3446]。因此，经结构改造后的环肽YM-216391的衍生物在结合并检测重金属离子方面也有很大的应用价值。

环肽YM-216391及其类似物的独特的化学结构和良好的抗肿瘤活性吸引了许多有机化学家从事其化学合成研究[Chem.Commun.(2005)8，797-799；Org.Biomol.Chem.(2008)6，1994-2010；J.Med.Chem.(2008)51，5722-5730；Org.Lett.(2006)8，4165-4167；Org.Lett.(2007)9，809-811]。化学合成方法得到的大量结构类似物可以用于构效关系的研究等，对多聚噁唑环-噻唑环类环肽药物发展具有重要意义。然而由于这些合成路线非常复杂，产率不高，因此还不能真正应用到药物生产中。而通过基因工程改造，利用微生物发酵的方法在提高环肽YM-216391的产量以及获得新的候选化合物方面都具有独特作用。

我们以链霉菌来源的环肽YM-216391为目标分子，从克隆其在Streptomyces nobilis JCM 4274(购自日本RIKEN生物资源中心)中的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过体内基因操作，异源表达、体外蛋白活性测定等方法，提高其发酵产量，研究其生物合成机理，并合理修饰YM-216391的生物合成途径，探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵的新型YM-216391结构类似化合物。

发明内容：

本发明涉及一种由高贵链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274产生的具有抗肿瘤活性的环肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。