[发明专利]一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法

说明书

技术领域

本发明属于动物肠道粘膜细胞分离和培养领域，具体涉及一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法。

背景技术

细胞是动物的结构和功能的基本组成单位，利用培养的细胞作为实验材料在细胞结构、功能损伤作用机理等基础理论研究、新型药物筛选、新型饲料添加剂研究等众多研究领域得到广泛性的使用，与活体动物（鱼类）相比较，具有研究周期短、实验条件容易控制、可以实现批量化的规模性实验、实验结果重复性好等优点，且使用原代培养细胞较使用细胞系进行实验的技术难度降低、实验成本降低，也更接近于鱼体自身生理条件。

鱼类是生活于水域环境的变温动物，与陆生恒温动物在许多方面有显著性的差异。现代基础科学研究和水产药物、水产动物营养产业发展需要建立鱼类细胞实验模型和研究的实验平台，这是推动鱼类基础研究和相关产业技术研究发展的重要关键性领域。鱼类肠道粘膜细胞是研究鱼类消化和吸收生理机制、饲料非营养物质对肠道损伤与修复机制、筛选防治肠道粘膜细胞损伤的药物或饲料添加剂的重要基础性实验模型和实验平台，具有重要的意义。

但是，现有技术中，鱼类肠道粘膜细胞研究领域目前还没有成熟的细胞系，因此只能利用肠道粘膜原代细胞作为细胞材料。利用从健康鱼体肠道分离肠道粘膜细胞并进行原代培养，以原代培养的粘膜细胞作为不同实验研究材料仍然面临下列难题：

⑴利用胶原蛋白酶分离肠道粘膜细胞是动物肠道粘膜细胞分离主要的技术，但传统方法主要适合陆生恒温动物如小白鼠、大鼠、家禽等，对于水生的变温动物不完全适用，具体地，首先，现有技术中适用于陆生恒温动物肠道粘膜细胞分离的胶原蛋白酶种类、酶浓度不适用于鱼类肠道粘膜细胞分离；其次，传统的方法是将肠道剪碎后进行胶原蛋白酶的消化处理，但得到的细胞、组织块、死细胞等混杂，是细胞的分离难度很大，同时，破碎的细胞、组织是细胞内溶酶体释放出很多水解酶类，对分离的细胞产生较大的影响。因此，需要研究一种适用于鱼类的肠道粘膜细胞的消化分离方法，要求得到纯净的、生理功能性完整的粘膜细胞、细胞团；

⑵现有技术中，通常采用鼠尾胶原作为细胞培养和生长的细胞支持载体，但是效果不理想，因此需要筛选适用于鱼类细胞培养、生长的细胞支持载体。我们利用鱼皮胶原蛋白作为鱼类肠道粘膜细胞培养的支持载体，细胞生长效果、细胞功能性显著优于利用鼠尾胶原的效果；

⑶需要调整鱼类肠道粘膜细胞接种的细胞、细胞团浓度，含有一定量的粘膜细胞团更有利于鱼类肠道粘膜细胞的生长，尤其是新生培养细胞的凝聚效果更好；

⑷现有技术中，适用于陆生恒温动物的细胞原代培养的条件不适用于鱼类，因为，例如：鱼类是长期生活在水域环境中的变温水生动物，其肠道粘膜细胞的培养条件如温度等与陆生恒温动物有很大的差异；鱼类是生活在水域环境中，鱼类细胞生长需要的参透压与陆生动物有差异，鱼类细胞培养液要做适当的调整。

发明内容

本发明目的是提供一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤，其中，所述取材步骤包括消化和分离、步骤，具体为：

1、消化：按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液：

方法一：使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的一端，向肠道内灌注体积为50%~70%肠道内容积的混合消化液，结扎剩余的肠道一端；然后在25~30℃水浴中消化20～40min，再向肠道加入含质量分数5~6%新生牛血清的DMEM，用镊子提起肠道的两端，反复振荡5～8次，终止消化；放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；

方法二：将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内，使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端，将肠道浸没在混合消化液中，在25~30℃水浴中消化20～40min，再向混合消化液中加入含质量分数5~6%新生牛血清的DMEM，反复振荡5～8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；

2、分离：取步骤1所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物，以所得粘膜细胞和细胞团的混合物作为原代培养的接种材料细胞；