[发明专利]中国南海疣镐芋螺神经毒素及其编码序列和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽及其编码序列和应用，尤其涉及一种芋螺神经毒素多肽及其编码序列和应用。

背景技术

芋螺，亦称鸡心螺，系软体动物门，腹足纲，前鳃亚纲，芋螺科(Conidae)动物之总称。芋螺是一类肉食性海洋软体动物，分类学上属腹足纲前鳃亚纲芋螺科，它们通过其毒管中的芋螺毒素麻醉动物以帮助捕食.芋螺根据其食性可以分为三类：食鱼性、食虫性和食螺性芋螺，其中食鱼性芋螺的毒素对人和哺乳动物毒性较大。芋螺毒素为其毒液中的有效成分，是一种具有独特神经药理作用的小肽，由7-41个氨基酸残基组成，一般富含二硫键。根据其二硫键的构成情况可分为两大类：含有多对二硫键及只含有一对或不含二硫键的。在近499种芋螺中据认为有超过49999种芋螺毒素肽，根据其前体信号肽序列可以分为几个超家族，如M、A和O)超家族，每个超家族的前体拥有共同的高保守的信号序列。

大量的研究表明，芋螺毒素具有独特的能够高特异选择性识别结合其作用靶(受体门控离子通道，电压门控离子通道)，产生拮抗剂(antagonist)或阻断剂(blocker)的作用。芋螺毒素识别其作用靶具有高特异性及选择性，它们只作用于某一类特定亚型的受体或通道。目前作用于受体门控离子通道的有nAchR拮抗剂、NMDA受体拮抗剂；作用于电压门控离子通道阻断剂的有Na⁺通道阻断剂、k⁺通道阻断剂Ca²⁺通道阻断剂等。

目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到，食虫芋螺的毒液研究的相对较少。至今已有数种芋螺毒素申请美国专利，它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。如由Olivera等从幻芋螺(Conus magus)中分离的ω-CTX，MVIIA，已被美国FAD正式批准为治疗顽痛的药物，其商品名Ziconotide。ω-芋螺毒素MVIIA是由25个氨基酸、3对二硫键组成的碱性亲水性小肽，C端酰胺化，N端为Cys。可选择性抑制N型电压敏感性钙通道，广泛用作神经生物学探针和无致瘾性镇痛剂，并具有多种药物发展前景；沿脊髓传递的Ziconotide能阻断伤害感受器释放神经传递素，阻止疼痛信号传入大脑，临床表现出强大的镇痛作用，效果优于吗啡等现有的镇痛剂，用于艾滋病、癌症及神经痛患者的治疗，无成瘾性，且疗效确切。来源不同的ω-CTX，尽管其氨基酸序列不同，但在结构上的差异都不是很大，如来自地纹芋螺(C.geographus)的GVIA、GVIC、GVIIA和GVOIB等，和来自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及来自线纹芋螺(C.striatus)的SO3等ω-CTX，在药理学方面有相似的作用。

我国关于芋螺毒素研究的报道不多，大多为综述芋螺毒素的研究概况及应用前景。卢柏松等，魏开华等对我国的少数几种芋螺(线纹芋螺，织锦芋螺和桶形芋螺)的毒素基因或毒液成份进行了研究。我国近海的芋螺约有70种，主要分布在海南岛，西沙群岛和台湾，大多数种类的芋螺毒素研究还未展开。由于每种芋螺毒液都有自己特定的药理学作用范围和生物学活性，因而使芋螺毒素具有重要的理论研究价值和应用价值。多样性的芋螺毒素既可直接用作天然药物，又可以作为设计新药(用于治疗重大疑难杂症)的先导化合物。深入研究芋螺毒素，不仅对海洋制药工业具有重要意义，而且可为我国芋螺海洋资源的开发利用提供重要理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因lv1.3。

本发明另一目的是提供上述神经毒素基因lv1.3编码的多肽lv1c。

本发明另一目的是提供上述多肽lv1c在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。

本发明所选择的疣镐芋螺属于中国南海食虫性疣镐芋螺(Conus lividus)，采自海南省三亚市。

本发明采用构建cDNA文库的方法，从中国南海疣镐芋螺毒管中克隆得到神经毒素基因lv1.3。

中国南海疣镐芋螺毒管cDNA文库的构建：分离毒管，提取总RNA反转录合成cDNA第一链产物；再以A超家族的信号肽和3’UTR为引物，以cDNA为模板通过PCR进行基因克隆，将PCR产物与pGEM-T Easy Vector相连，连接产物转化液分别涂平板，从平板上挑取单克隆进行测序。得到中国南海疣镐芋螺神经毒素基因lv1.3，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。