[发明专利]一种莱茵衣藻目标基因敲除方法

权利要求书

1.一种莱茵衣藻目标基因敲除方法方法，其特征在于：包括pMCS-SPA-MCS载体和pTSBIR-XIR载体的构建；

1)、中间载体pMD285的构建

以TAKARA公司pMD-18T Simple载体为基础，通过设计合成多克隆位点和间隔区序列，最后插入pMD-18T Simple载体，得到中间载体pMD285；

A、多克隆位点的设计

选择实验室常用的TAKARA公司生产的pMD系列载体T克隆位点两端的常用内切酶位点作为间隔序列两端的酶切位点；

B、间隔序列的选取

以在转基因受体藻株中惰性为原则，选取pCAMBIA1302上的一段180bp在莱茵衣藻基因组中无同源性的一个片段作为间隔序列；

C、两端带有多克隆位点间隔序列的合成

将设计好的两端带有多克隆位点的间隔序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成，所得序列如序列表<400>1；同时，为两端带有多克隆位点的间隔序列设计一对引物：

MCSF：5’-CGCAGAATTCTGCAGATATC-3’

MCSR：5’-GGTCGAATTCCAGCACACTG-3’

通过PCR的方法将该序列克隆到pMD-18T Simple载体上；

D、克隆载体的选取

选取pMD-18T Simple作为克隆载体；

E、两端带有多克隆位点的间隔序列插入pMD-18T Simple

利用引物

MCSF：5’-CGCAGAATTCTGCAGATATC-3’

MCSR：5’-GGTCGAATTCCAGCACACTG-3’

进行PCR扩增，回收PCR产物并连接pMD-18T Simple载体，连接产物转化DH5α细胞，提取质粒则得到pMD285中间载体；

2)、RNAi载体pTSBIR-XIR的构建

A、克隆色莱茵衣藻色氨基酸合成酶β亚基基因3’端非编码区450bp的片段；通过引物

TBSF：GCACTGTGCTTTGACAGACAAG；TBSR：CGATTGGTAGCAACAAAGTGAGT

PCR扩增得到TBS基因反向重复序列，分别插入载体SP124S Ble基因3’端非编码区区域，得到含TBS反向重复序列的中间载体；

B、以SacI/KpnI从pSI103载体上将aphVIII gene表达框切下，补平，连入步骤1得到的中间载体，得到RNAi载体pTSBIR-XIR。