[发明专利]一种靶向抗肿瘤重组蛋白质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种靶向抗肿瘤重组蛋白质药物及其基因工程制备方法。

背景技术

对于肿瘤治疗最重要的是首先要能相对准确区分开肿瘤细胞和正常细胞，高效特异性杀死肿瘤细胞，而这种准确区分的能力也是癌症治疗研究的热点之一，也就是所谓的靶向杀伤肿瘤的策略。靶向杀伤肿瘤的策略是基于肿瘤细胞表面的特殊标志物或过表达的特异受体作为靶向，使细胞毒性药物在靶向物质的引导下，相对集中于肿瘤细胞周围并将其杀死，而对于正常细胞却无损害。利用细胞因子与受体的特异性结合的能力，根据某些细胞因子受体在肿瘤细胞表面过量表达，而正常细胞基本没有的这一事实，利用细胞因子携带细胞毒素特异杀伤肿瘤细胞就是其中的一种靶向杀伤策略。利用细胞因子作为导向药物的研究已经有很多，表皮生长因子受体在磷状上皮癌发生时表达异常增多，如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等；转化生长因子受体的导向意义与表皮生长因子受体基本相同；神经分化因子受体为酪氨酸激酶家族，许多癌细胞都有高含量表达；粒细胞集落刺激因子受体在白血病细胞、口腔癌细胞、膀胱癌细胞等都有较高表达；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体在骨肉瘤细胞、腺癌细胞上有高含量分布；IL-2R在T细胞白血病和淋巴瘤细胞中有较高分布；IL-4R在淋巴瘤细胞中、IL-6R在急性髓样白血病细胞、骨髓瘤细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞等有较高分布；IL-9R在Hodg kin氏瘤细胞、IL-13R在肾细胞瘤和细胞胶质瘤等有较高表达。这些细胞因子已有与绿脓杆菌外毒素(PE，Pseudomonas exotoxin)制备过重组毒素研究报道。利用肿瘤细胞表面标志分子，利用抗体与肿瘤细胞抗原结合特性，利用抗体作为导向部分携带毒素分子，可明显提高靶向选择性有效杀伤靶细胞，如单抗放射性碘治疗原发性肝癌药物-美妥昔单抗注射液导向性能良好。激素分子如LRH、α-促黑素等与PE结合，都能很好地起到导向作用；重组毒素是靶向治疗癌症较好的策略之一。

PE毒素是结构与其分子作用机理已研究的非常清楚，也是目前使用最多的一种细胞毒素，其作用于真核核糖体上的蛋白合成因子EF₂，使其糖基化，使蛋白合成终止而死亡；PE毒素分子被修饰和改造出现了几种衍生物，主要是缺失细胞膜亲和区，使其失去细胞结合能力，同时使用KDEL序列替换REDLK，增加其核糖体亲和性，其细胞毒性增加3倍以上，目前最常用结构有PE40KDEL和PE38KDEL，目的在于减少其分子量、增加细胞毒性、增加分子穿透力和降低体内免疫学反应的副作用。

我们利用hIL6作为导向载体，主要根据某些肿瘤细胞过表达IL6R这一事实，而血液细胞和组织细胞表面带有IL6R数量的非常少，即使有表达量也非常低这一事实，利用hIL6携带毒素PE38KDEL与细胞表面的IL6R特异性结合，在受体的介导下使重组毒素相对集中在肿瘤细胞膜上，形成复合物，经重组毒素分子内化段诱导的内化作用，使PE38KDEL分子进入结合的细胞内，在哺乳动物细胞内furin酶的作用下切下一个37kDa的PE分子，这个分子特异地与核糖体上的蛋白合成因子EF2结合，使蛋白合成终止，细胞因缺乏酶的合成而死亡。几个种类的肿瘤细胞表面IL6R呈现过表达现象，在骨髓瘤细胞、肝癌细胞、急性髓样白血病细胞和前列腺癌、结肠癌细胞等均高于正常细胞10倍以上，即肿瘤细胞上相应受体数均在3000～4000个以上，骨髓瘤细胞U266上最多含20000(如U266)个/细胞左右。重组毒素杀死肿瘤细胞需要一定的分子数，主要取决于细胞膜受体数和内化效率，由于IL6R受体在肿瘤细胞上表达与正常细胞上至少相差10倍以上，有的甚至达千倍以上，这使肿瘤细胞上聚集的重组毒素比正常细胞多得多，而对正常细胞的毒副作用减到最低，甚至不呈现毒副作用。据实验分析证明，保证杀死一个瘤细胞其周围需要400～1000个左右的毒素分子。正常细胞上IL6R的受体数都少于200个，同时重组毒素分子内化的效率一般在15％左右，毒素分子对正常细胞发挥不了明显的毒性作用。

虽然美国Ira Pastan领导的课题小组率先构建了IL6PE40，紧接着国内朱平、柳增善小组构建了IL6(23)PE40，溪永志小组构建了IL6(23)PE40KDEL；但Ira Pastan和奚永志小组在大肠杆菌均以包涵体表达，该蛋白复性率低，复性后活性略低于可溶性表达产物；朱平、柳增善小组构虽然实现了可溶性活性表达，但表达量只有5％左右，成为了该毒素大量制备的瓶颈。