[发明专利]一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒。

背景技术

狂犬病又名恐水症，是一种侵害中枢神经系统的急性病毒性传染病，多由患病的动物咬人而得，一旦发病死亡率高达100％。目前国内外预防狂犬病的主要手段是对暴露人群注射狂犬病疫苗。世界卫生组织建议，狂犬病毒的中和抗体滴度达到0.5IU/ml时具有保护力。对于已注射疫苗的人血清中抗狂犬病毒抗体滴度的评价，可以作为临床评估该疫苗有效性的指标。

目前常用的检测狂犬病毒抗体的检测方法有荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、快速荧光斑点抑制试验(RFFIT)、小鼠中和试验(MNT)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)。其中酶联免疫吸附试验操作安全，灵敏度高，结果稳定，准确性强，得到普遍的认可。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，包括：

1)包被有0.05μg/ml～0.1μg/ml重组狂犬病病毒G蛋白的酶标板；

2)样品稀释液：含有0.5‰～1‰酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液；

3)洗涤液：含有0.5‰～1‰吐温的磷酸盐缓冲液；

4)酶标记物：用辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗人IgGFc片段单克隆抗体；

5)显色剂A：含有0.4‰～0.6‰过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；

6)显色剂B：含有0.2‰～0.25‰四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液；

7)终止液：1.5mol/L～2mol/L硫酸溶液；

8)阴性对照：正常人血清；

9)阳性对照：含有狂犬病毒抗体的人血清。

前述的试剂盒，所述重组狂犬病病毒G蛋白按照下述方法制备，包括步骤：

1)以编码狂犬病病毒G蛋白的碱基序列作为目的基因片段：根据NCBI上公布的数据以及亲/疏水性程序软件分析，选取狂犬病病毒G蛋白全序列从149位502位的共354个氨基酸残基所对应的碱基序列作为目的基因片段，合成共1062个碱基(bp)的目的基因片段；

2)将该目的基因片段通过表达载体导入宿主细胞，筛选得到表达狂犬病病毒G蛋白的工程细胞；

3)培养工程细胞，得到包涵体；

4)破碎细胞，纯化，得到重组狂犬病病毒G蛋白。

前述的试剂盒，所述表达载体为pET系列质粒(pET-5a)。

前述的试剂盒，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供上述检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)加样：取包被好的酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔、阳性血清对照孔和样品孔，在各孔先加样品稀释液100μl，再依次向各对应孔中加入阴性血清、阳性血清和样品各10μl，混匀。空白对照孔只加样品稀释液100μl。贴上不干胶条，置于37℃温育20min。

2)洗板：倒扣掉酶联板中的液体，并向各孔加入洗涤液300μl，静置30s后，扣掉酶联板中的液体，反复洗涤5次，最后一次要将液体拍干。

3)加二抗：向各孔中加入二抗酶标记物100μl，空白对照孔不加，贴上不干胶条，置于37℃温育20min。

4)洗板，同步骤2)。

5)显色：依次向各孔加显色剂A和显色剂B各50μl，混匀，置于37℃温育15min。

6)终止：依次向各孔加入终止液50μl，混匀。

7)测定：用酶联仪对空白孔调零，测定各孔的光吸收值(OD值)。

8)判定结果：根据测定OD值与临界值(cut-off值)的比值判断。若比值大于1，则该血清为阳性，说明其中含有狂犬病毒抗体，疫苗具有保护效力；若比值小于1，则该血清为阴性，说明其中不含抗体。

临界值的确定：

用注射过狂犬病毒疫苗的人血清对小鼠进行脑内中和试验，并测定中和抗体效价，将未注射过狂犬疫苗的人血清稀释至0.5IU/ml。对1000份上述血清按照步骤1)-7)进行酶联免疫吸附试验，测得的OD值求平均以及标准差(SD)，

本发明提供的检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒，用于在注射过狂犬病毒疫苗后，检测血清中是否存在相应抗体，以评价免疫效果。本发明是利用间接酶联免疫吸附试验检测狂犬病毒抗体的试剂盒，以抗体滴度为0.5IU/ml的内部质控血清测定值作为临界值(cut-off值)，具有高灵敏度和特异性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。