[发明专利]一种利用肌苷提高聚合酶链式反应扩增效果的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法，尤其是肌苷(Inosine)提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)，又称体外酶促基因扩增，是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，该技术由K.Mullis于1985年发明，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间里就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。

在过去的20多年的时间里，PCR技术在不断进步和发展中逐渐成熟，形成了一整套完整的技术体系。常规PCR技术操作简便，成功率很高，因而其在遗传学、微生物学、乃至整个生命科学领域的研究中都得到了广泛应用。但是PCR技术仍存在着不可避免的缺点，如扩增的副反应多，扩增产物的产量少，保真度不高等。但对PCR反应影响最大的是扩增过程中的副反应的发生，这种情况轻则带来在PCR产物中出现少量非目的产物，电泳图上表现为明显的非目的带和少量拖尾现象的出现，重则带来大量的非目的产物出现，在电泳图上表现为干扰很严重的拖尾和大量的弥散，导致主带模糊或根本无主带，整个扩增失效。虽然近年来一个又一个功能强大的引物设计软件被开发出来，但高特异性引物只是提高PCR反应效率的一个方面，对反应体系及反应条件进行优化组合则是解决这一问题的主要方面。根据多年来各国科学家的研究成果我们发现，通过向PCR反应体系中添加一定量的添加剂可以在不同程度上减少或消除副反应的发生。这些添加剂包括DMSO，Betain，BSA，甘油，Tween-20，NP-40，甲酰胺等。但这些添加剂都有各自的局限性，在各种不同的情况下效果差异很大，给应用带来不便。因此开发更多更新的PCR反应优化剂是发展PCR技术过程中一项很重要的工作。

鉴于PCR反应本身是一种模拟体内DNA复制的体外扩增方法，因此在本发明的摸索过程中，试图从模拟细胞核内环境出发，寻找参与酿酒酵母细胞代谢的核内，并设计将这些核内以接近核内浓度的条件下添加入PCR反应体系中，以期获得更为有效的PCR添加剂。肌苷Inosine就是通过这个思路被我们发现有明显增进PCR反应特异性的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种利用肌苷(Inosine)提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法。该方法通过在PCR反应体系中添加肌苷达到对DNA片段的有效扩增。此方法明显提高了反应特异性，应用成本低，使用简便，易于掌握。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

利用肌苷提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的方法是：

1)肌苷溶液的配制：10-20mg/mL的肌苷水溶液；

2)肌苷溶液的灭菌；

3)PCR体系的配置；

4)PCR体系的优化：在PCR反应体系中添加肌苷溶液，肌苷终浓度为5-15mg/mL；

5)PCR条件的设定与运行；

6)PCR产物检测。

而且，所述的PCR体系的优化是：肌苷终浓度的优选浓度为6.0-6.5mg/mL。

而且，所述的肌苷溶液是指：肌苷完全溶解于纯水、10×PCR缓冲液或者其它一切适用于PCR反应的液相中。

本发明的优点和有益效果是：

1.本发明作为PCR增效剂的新成果，与已有方法相比，肌苷优化扩增的效果明显，确实提高了PCR扩增的特异性，且肌苷较为低廉的价格使得其应用没有增加很多成本。

2.本发明中使用的PCR优化试剂肌苷，添加到体系中基本不影响PCR反应后的一般后续操作如电泳分离DNA产物。

3.该肌苷提高聚合酶链式反应(PCR)扩增效果的优化方法易于掌握，使用简便。

附图说明

图1为本发明中利用肌苷优化扩增片段长度为900bp左右的非高GC-DNA片段的结果电泳图与不添加肌苷的反应结果电泳图的对比图；

图2为本发明中利用肌苷优化扩增片段长度为750bp左右的高GC-DNA片段的结果电泳图与不添加肌苷的反应结果电泳图的对比图。

具体实施方式

本发明结合附图通过以下实施例进一步详述，但不局限于下述实施例。

本发明所涉及的PCR技术的优化方法是通过向PCR体系中添加肌苷来实现的，其具体操作方法如下：

1.肌苷(Inosine)溶液的制备：