[发明专利]渥堆发酵普洱茶中微生物总DNA的提取方法

权利要求书

1.一种从渥堆发酵普洱茶中提取分离微生物总DNA的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)取不同发酵过程中的普洱茶样品；

2)对提取的普洱茶样品进行预处理；

3)提取预处理后样品中微生物的总DNA；

4)将提取的微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测；

5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增，得到扩增后的总DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤1中所述不同发酵过程为：在普洱茶渥堆发酵过程中以每次翻堆为时间点取堆中不同空间位置的茶叶样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤2中所述预处理包括：取茶叶样品，使用液氮冷冻研磨得到粉末。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤3中所述的提取方法如下：预处理的样品，使用Omega soil DNA提取试剂盒进行提取，操作步骤根据试剂盒的说明进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤5中所述的专用引物为：第一步扩增采用的引物为16s1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16s2：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，

第二步扩增采用的引物为338fGC：

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’和R518：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中PCR反应体系为37uLddH2O，5uL 10*反应缓冲液，2uL PCR引物P1，2uLPCR引物P2，2uLdNTP，1uLTaq酶，1uL模板，PCR扩增程序为：起始94℃预变性5min；94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸90s，30个循环：72℃终延伸10min，得到大曲微生物PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳缓冲液为1xTAE缓冲液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤4中所述的琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于确定总DNA的谱图，所用方法采用常规技术，包括制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶的变性梯度为30％～60％，使用的电泳缓冲液为1xTAE，电压150V，60℃，电泳8h，sybrgreen染色20min，得琼脂糖凝胶电泳图谱，通过该图可分析比较渥堆发酵普洱茶微生物种群多样性程度。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，包括以下步骤：

1)取不同发酵过程中的普洱茶样品：在普洱茶渥堆发酵过程中以每次翻堆为时间点取堆中不同空间位置的茶叶样品来测动态的微生物的群落构成；

2)对提取的普洱茶样品进行预处理：取5g茶叶样品，使用液氮冷冻研磨3次，转移到2ml离心管中；

3)提取预处理后样品中微生物的总DNA：加入200mg玻璃珠，使用Omega soil DNA提取试剂盒对处理好的茶叶样品进行提取，加入600ul SLX溶液，高速振荡10min混合均匀，70度水浴10min，期间混合样品数次，加入200ul SP2溶液，混合均匀，冰浴5min，13000g离心5min，上清转移到一个新的离心管中，加入0.7倍异丙醇，颠倒混匀，13000g离心10min，弃去上清，倒置于吸水纸上干燥，加入200ul elution buffer到离心管中，混匀，65度水浴20min溶解DNA，加入50ul HTR溶液，混合均匀，室温放置2min，13000g离心2min，将上清转移到一个新的离心管中，如果上清依旧带有深色物质重复加入HTR溶液处理，加入等体积的XP2溶液，充分混合均匀，之后将所有溶液转移到HiBind DNA柱子中，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，加入300ul XP2溶液，10000g离心1min，弃去流出液和收集管，把柱子放入一个新的收集管中，加入700ul经无水乙醇稀释过的SPW wash溶液，10000g离心1min，弃去流出液重新使用收集管，再用700ul SPW wash溶液洗一次，弃去液体，把柱子插入空的收集管中，13000g离心2min，将柱子放入50度烘箱30min，把柱子放到一个新的离心管中，加入50ul elution buffer到柱子中心，65度水浴10min，13000g离心1min，将离心洗脱液重新加入柱子中，65度水浴10min，13000g离心2min，所得洗脱液即为提取好的微生物总DNA；

4)将提取的微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测：以每个样品5ul的上样量在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测样品总DNA，电泳条件为120v，30min；

5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增：所用16s引物序列为338f：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，r518：ATTACCGCGGCTGCTGG；所用18s引物序列为GLOL：GCCTGCTTTAAACACTCTA，NS31：TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC，PCR反应体系为37uLddH2O，5uL 10*反应缓冲液，2uL PCR引物P1，2uLPCR引物P2，2uLdNTP，1uLTaq酶，1uL模板，PCR扩增程序为：起始94℃预变性4min；94℃变性45s，50℃引物复性45s，72℃引物延伸90s，30个循环：72℃终延伸10min；

6)将PCR扩增好的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测：以每个样品5ul的上样量在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳条件为120v，25min。