[发明专利]全细胞生物合成脱氧核苷三磷酸的新技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种由脱氧核苷一磷酸dNMP合成脱氧核苷三磷酸dNTP的方法。 

背景技术

脱氧核苷三磷酸是人工合成DNA的必备前体原料，人工合成DNA片段广泛应用于基因工程、分子生物学、生命科学、基因药物等方面。三磷酸脱氧核苷是各种DNA聚合酶促反应的底物，是DNA序列分析、基因分析、定点突变、PCR(Polymerase ChainReaction)、RT-PCR、反转录和DNA标记反应不可缺少的低分子量生物有机分子。而DNA序列分析、定点突变、PCR及DNA芯片技术是现代分子生物学、生物化学和现代生物医学研究不可缺少的技术。尤其是PCR技术具有操作简单应用广泛等特点，它在基因分子克隆、蛋白质工程、生物医药研发、遗传和传染性疾病诊断、法医鉴定、亲子检定等领域得到越来越广泛的应用。 

随着生物技术研究和工业化中DNA合成的PCR应用，dNTP的需求在稳定地增长。目前世界上只有少数几家企业能够生产三磷酸脱氧核苷，所采用的方法主要是利用脱氧核糖核酸水解产物的酶促或化学磷酸化，终产物的获得要求多步反应，生产工艺繁琐，产物转化率低。 

商业上主要通过化学方法生产dNTP，反应是以dNMP相应的三丁基铵盐和正磷酸为底物，以二环己基碳二亚胺(DCC)为催化剂，在吡啶或者二甲基酰胺(DMF)等有机溶剂中进行。化学法生产得到不同dNTP的产率为40～80％。然而，纯化反应混合物中的各个dNTP组分，其过程十分复杂并且成本很大，它需要分离非活性的dNMP、dNDP、DCC和正磷酸以及副产物如脱氧核糖核苷四磷酸或五磷酸等。另外，因为废气处理的原则很严格，吡啶或者DMF溶剂一定要被还原，分离，然后回收。因此，化学法有很大的环境污染，并且通过反应和纯化后它的得率很低，成本也相对较高。 

从经济和环境因素考虑，近年世界上已出现酶法合成脱氧核苷三磷酸，此法比化学方法更具优势。dNTP的合成需要两个酶磷酸化的反应，从dNMP生成dNDP和第二步生成dNTP。Ladner和Whitesides由从鲱鱼精子DNA中分离的脱氧核苷一磷酸(dNMP)混合物合成dNTP[Ladner W，Whitesides G.Enzymatic synthesis of deoxyATP using DNAas starting material[J].J Org Chem，1985，50：1076-1079]。近年来，Jie Bao，Dewey D.Y.Ryu等人成功将编码四种脱氧核苷单磷酸激酶的基因从Saccharomyces cerevisiae ATCC2610菌株的基因组中分离出来，分别为编码脱氧腺苷酸激酶(AK)的ADK1，编码脱氧鸟苷酸激酶(GK)的GUK1，编码脱氧胞苷酸激酶(CK)的URA6，以及编码脱氧 胸苷酸激酶(TK)的CDC8基因。他们将这些基因克隆到E.coli BL21(DE3)菌株中，并使AK，GK，CK，TK过量表达。用纯化的脱氧核苷酸激酶实现从脱氧核苷单磷酸到脱氧核苷二磷酸的转化。第二步加入从家兔肌肉中提取的丙酮酸激酶(PK)实现从dNDP到dNTP的转化[Bao J，Ryu DDY.Total Biosynthesis of Deoxynucleoside Triphosphates UsingDeoxynucleoside Monophosphate Kinases for PCR Application[J].Biotechnol Bioeng.2007，98(1)：1-11]。尽管如此，dNTP的产率仍较低，只有25％左右[Bao J，Bruque GA，RyuDDY.Biosynthesis of deoxynucleoside triphosphates，dCTP and dTTP：Reaction mechanismand kinetics[J].Enzyme Microb Technol.2005，36：350-356；Bao J，Ryu DDY.Biosynthesisreaction mechanism and kinetics of deoxynucleoside triphosphates，dATP and dGTP[J].Biotechnol Bioeng.2005，89：485-491]。另外，世界上已有数家研究机构正在研发核苷酸还原酶，但这些正处在研发阶段的核苷酸还原酶大都有反应条件复杂和酶稳定性差等缺点，不适合工业化，应用范围有限。