[发明专利]具有抗栓活性的低分子量蚓激酶

说明书

技术领域  生物医药

蚯蚓(地龙)是我国沿用数千年之久的传统中药。它主要用于“活血通络”等诸多方面，可治疗中风、痹症、惊厥、炎症等征候，凡四十余种。自上世纪八十年代国外学者从蚯蚓体内发现了具有抗栓溶栓作用的“蚓激酶”以来，世界各国，尤其是中国大力开展了对该类成份的研究和开发。一九九五年“蚓激酶胶囊”作为抗栓新药在我国获准上市。多年来生产厂家和产量不断增加，市场情况良好。

口服蚓激酶虽然具有疗效确切，使用方便、价格低廉、副作用小等优点。但它起效慢，难以用于血栓类疾病的急性期抢救和治疗。目前可用的注射用抗栓溶栓生物制剂都存在着某些不足，如有效时间短(如尿激酶UK)、毒副作用明显(如蛇毒、链激酶SK)、价格昂贵(如组织纤溶酶原激活剂tPA)等。因此二十多年来人们对蚓激酶注射剂的研究和开发始终没有停止过。随着研究的深入，人们也发现蚓激酶作为药物开发有一些缺点：(1)蚓激酶在蚯蚓体内的含量很低，仅占体重的千分之一以下。(2)蚯蚓体内的杂质数量和含量都很大，研究表明，蚓激酶体内存在着性质相近的5-9种同工酶，分离纯化困难较大，很难得到纯净组分的单一同工酶。所以一般来说，纯化蚓激酶的步骤多、时间长、活性丢失多、回收率低、成本高，很难对单一同工酶的纯化进行产业化生产。国内目前正在申报的蚓激酶注射液是一种包含3种同工酶(分子量为24-30KD)的混合制剂。(3)目前已发现有溶栓活性的蚓激酶分子量多在24-40KD，蚓激酶作为来源于低等动物的大分子异体蛋白，对人体有一定的抗原性。

针对以上问题，有些学者采用基因工程方法，在大肠杆菌或酵母细胞中表达获取蚓激酶，但结果是收率不高或者活性较低，难以与天然蚓激酶匹敌。

目前公认的蚓激酶分子量为24-40KD，生产厂家在生产时一般将低于20KD的蚯蚓提取液作为废物丢弃。我们从生产厂家当作废弃物的低于20KD的蚯蚓小分子量组分中，成功分离出2种新的蚓激酶组分，它们均有抗栓作用。通常小分子量的蛋白作为药用时产生的抗原性较小，所以我们新发现的这2组分在将其开发成注射药物方面具有很大的优势。

本研究以赤子爱胜(Eisenia foelide)蚯蚓为原料，通过超滤、离子交换和凝胶过滤等方法，分离得到2个小分子量的蚓激酶组分F1和F2，对其进行了初步的药理学活性研究，发现这些低分子量的酶蛋白也同样具有抗血栓的作用，

本项发明的显著特点是：(1)我们得到的具有抗栓活性的蚓激酶是小分子类型的，目前已报道公认的蚓激酶分子量均在24-40KD之间，而我们得到的F1的分子量为20±1KD，F2的分子量仅为9±1KD，是目前发现的已知蚓激酶中分子量最小的同工酶。由于是小分子蛋白，在将其开发成注射溶栓药物方面就具有很大的优越性。(2)我们获得的组分F1和F2经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳发现是单一组分。由于蚯蚓体内的蚓激酶同工酶较多，分离单一成分的同工酶比较困难，而我们经过分离纯化最后得到的是电泳纯级别的蛋白组分。(3)本发明中采用的分离纯化方法简单，步骤少；仅通过超滤、离子交换和凝胶层析等3个主要步骤，就可以得到电泳纯的蛋白组分。由于蚯蚓体内同工酶性质接近，一般分离一种纯的同工酶需要多个步骤，步骤的增加导致纯化时间长、活性丢失多、得率降低以及成本较高等。本方法在这方面具有非常显著的优势。

在本发明中，将赤子爱胜(Eisenia foelide)蚯蚓匀浆后，得到提取液，将提取液通过超滤、离子交换和凝胶过滤等3个主要步骤，即可获得2个电泳纯级别的蛋白组分，我们将这两个组分分别命名为F1和F2。组分F1是通过将蚯蚓的蛋白提取液超滤后再进行离子交换层析得到的，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量为20±1KD；组分F2是通过将从离子交换层析中的流出液再进行Sephadex 75层析得到的，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定其分子量为9±1KD。

将组分F1进行氨基酸序列测定，得到2个肽段，分别长60和36个氨基酸残基。利用Mascot检索软件进行检索，发现这2个肽段的氨基酸序列分别与已报道的一个蚓激酶(蛋白序列号ABW04906，分子量26.2KD)的氨基酸序列在2处完全匹配，但我们的蛋白F1的分子量较小。序列1(见后面序列表1)是已知的蚯蚓纤溶酶序列(蛋白序列号ABW04906)，其中的黑体字是对比时两者序列一致的氨基酸序列，也是F1蛋白测定出的氨基酸序列部分，共2个部分，长度分别为60和36个氨基酸。