[发明专利]微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术应用及环境保护领域，具体涉及微囊藻毒素降解酶MlrA的全长cDNA序列、编码氨基酸和应用。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是一类在蓝藻水华中出现频率最高、造成危害最严重的藻毒素，可造成野生动物、家畜、家禽等中毒死亡，并引发人类肝损伤和肝癌高发等危害。该毒素已确定了60多种异构体，最常见的为MC-LR、MC-RR和MC-YR三种。

对于MC的生物降解，Bourne等认为MC-LR的降解至少是由细胞内的3种水解酶促成的。Bourne等(Bourne D G，Riddles P，Jones G J，et al.2001.Characterization of a gene cluster involved in bacterial degradation of thecyanobacterial toxin microcystin LR[J].Environ Toxicol，16：523-534.)通过研究发现了藻毒素降解基因组MlrA，MlrB，MlrC和MlrD，其中，类金属蛋白酶MlrA是MC-LR降解最重要的酶，它能使稳定的MC-LR开环，开环后生成的线性MC-LR分子活性比MC-LR降低了160倍，从而使母体毒性大大降低。Saito等(Saito T，Sugiura N，Itayama T，et al.2003.Biodegradationof microcystis and microcystins by indigenous nanoflagellates on biofilm in apractical treatment facility[J].Environmental Technology，24(2)：143-151.)通过试验证实了MlrA对藻毒素的降解作用，还进一步说明了该基因对降解藻毒素的独特性和专一性。

近十几年，国内外开展了大量利用微生物方法降解MC的研究。但由于藻毒素具有环状结构和间隔双键，具有强的化学稳定性和对细菌肽酶的抵制作用，使得微生物法降解藻毒素效果不够理想。因此众多研究者也都将目光集中于筛选高效降解藻毒素的菌种及降解机理方面。

近年来，国内对MC降解技术主要集中在环境行为、毒理效应以及分离检测等方面，而对于去除MC，则更多的停留在高藻水的处理方面，如强化预氧化、化学药剂以及絮凝沉淀等单元操作，通过去除藻细胞间接地降低水中MC的质量浓度。这些降解技术存在成本较高，工作量大，而且无法彻底去除MC等诸多问题。相比之下生物法因具有处理成本低、操作简便、不易引起二次污染等特点而更具研究意义和发展前途。

MC降解菌有鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和青枯菌(Pseudomonas solanacearum)。其中鞘氨醇单胞菌和铜绿假单胞菌分别以微囊藻毒素酶和碱性蛋白酶降解微囊藻毒素。

如何消除水体MC的污染是世界各国共同面临的一个问题。虽然目前对MC降解酶的机制的主要框架已有所了解，但是如何利用MC降解酶的机制去指导应用，则是当前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可高效去除水体中的微囊藻毒素，且对微囊藻毒素具有独特性和专一性的MlrA基因的全长cDNA序列。

本发明的另一个目的在于提供上述MlrA基因的全长cDNA序列所编码的氨基酸序列。

本发明的另一个目的在于提供上述MlrA基因所表达的蛋白在优化养殖水体或作为养殖鱼类饲料添加剂中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一、MlrA基因的全长cDNA序列的获得

采集不同季节水环境中的表层水体，将表层水体经过滤、离心处理后，所得作为水样模板。采集鱼类肠道内排泄物，经过滤、离心处理后，所得作为肠道样品模板。

设计一对MlrA基因的特异引物F1和F3：

上游引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

下游引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

利用上述引物和模板，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系：待测样品1μl、10×PCR buffer 5μl、dNTPs(10mMeach)4μl、MlrA引物F1 1μl、引物F3 1μl、Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH₂O至50μl。