[发明专利]一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法

权利要求书

1.一种水果或蔬菜上洋葱伯克氏菌群的检测及种的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)取有腐烂症状的蔬菜或水果的病健交界处组织，在无菌水中捣碎后，涂布于PCAT平板上，培养后挑取乳白色的单菌落，纯化后提取菌株的DNA；

(2)以每个菌株的DNA为模板，利用引物BCR1和引物BCR2进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，假如凝胶呈现1043bp的条带，说明该菌株属于洋葱伯克氏菌群；

(3)用内切酶HaeIII对经鉴定属于洋葱伯克氏菌群的菌株的PCR产物进行酶切，获得限制性酶切图谱，初步确定菌株的种；

(4)以初步确定种的菌株的DNA为模板，利用相应种的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳分离后用指示剂显色，假如凝胶呈现条带，则确定该菌株的种与初步确定的种一致；

(5)假如凝胶未呈现条带，则对该菌株步骤(2)中的PCR产物进行测序，得到其recA序列，构建分子系统树，确定该菌株的种。

2.根据权利要求1所述的检测及种的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)提取菌株DNA的方法如下：将菌体置于细胞裂解液中，于92～97℃加热10～20min，用双蒸水或TE稀释，所述的细胞裂解液包括重量百分比为0.25％的SDS和0.05mol/L NaOH。

3.根据权利要求1所述的检测及种的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为：

94℃预变性3min后94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的检测及种的鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中15μl酶切体系包括：

PCR产物        10μL

10×buffer     1.5μL

HaeIII内切酶   1μL

ddH₂O          2.5μL。