[发明专利]一种2-D-阿拉伯醇脱氢酶基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及假丝酵母H2(Candida sp.H2)的2-D-阿拉伯醇脱氢酶基因及其重组蛋白，更具体地说，涉及一种从假丝酵母H2(Candida sp.H2)中分离到的基因，利用基因工程方法构建的工程菌，以及使用工程菌生产D-阿拉伯醇。 

背景技术

D-阿拉伯醇(D-arabitol)是一种白色晶体、有甜味、旋光度为138°的五糖醇。作为耐高渗微生物的重要产物之一，它广泛存在于自然界，主要应用于在食品、化工、医药等行业。目前，D-阿拉伯醇最具市场潜力的用途在于作为原料合成木糖醇。 

人们对积累D-阿拉伯醇菌株的研究始于20世纪中期，国外报道比较多，而国内研究比较少。据报道，绝大多数耐高渗菌株都能够合成D-阿拉伯醇，但高产D-阿拉伯醇的菌株不是很多；也有部分高产菌株被筛选得到，主要集中于真菌。当前，微生物发酵D-葡萄糖合成D-阿拉伯醇的方法主要存在收率低、发酵周期长，副产物多等缺点。针对于这些缺点，利用基因工程进行改造或者重新构建工程菌显示出广阔的前景。 

目前，对于2-D-阿拉伯醇脱氢酶及其基因的研究甚少。从已经报道的结果来看：大部分基因长度为843-849个碱基，一级结构为281-283个氨基酸，通过氨基酸序列的分析表明其属于短链脱氢酶家族；获得的方法主要是通过构建基因组文库和λ-cDNA文库或通过纯化原始蛋白。但是未见通过所获得的2-D-阿拉伯醇 脱氢酶基因构建基因工程菌进行研究的报道。 

此前，本申请人通过选育已经获得一株D-阿拉伯醇高产菌株假丝酵母H2(Candida sp.H2)。该假丝酵母菌株H2已于2009年8月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3255。对假丝酵母H2(Candida sp.H2)中的2-D-阿拉伯醇脱氢酶的基因及其重组蛋白进行研究具有很大的现实意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新的2-D-阿拉伯醇脱氢酶基因及其重组蛋白和含有该基因的大肠杆菌及其应用。 

为实现上述目的，本发明通过PCR从假丝酵母H2(Candida sp.H2)中克隆到一个2-D-阿拉伯醇脱氢酶基因；利用基因工程方法构建重组质粒且转入大肠杆菌表达系统中构建基因工程菌；为采用工程菌以葡萄糖为底物生产D-阿拉伯醇提供了一条可行的途径。 

本发明实现其目的所采取的技术方案是：该2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因所编码的重组蛋白重组蛋白为2-D-阿拉伯醇脱氢酶，具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。 

进一步地，本发明所述重组蛋白的重组载体为含有2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因的pET30-a表达载体，所述2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明提供的大肠杆菌是在大肠杆菌BL21(DE3)中含有2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因，该2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列。 

进一步地，本发明所述大肠杆菌中的重组载体为含有2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因的pET30-a表达载体，所述2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明所述的大肠杆菌用于制备D-阿拉伯醇的应用是该大肠杆菌经过诱导后以核酮糖或葡萄糖为底物合成D-阿拉伯醇。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)从假丝酵母H2(Candida sp.H2)中分离得到的2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因为一个新的基因；(2)本发明首次公开了将2-D-阿拉伯醇脱氢酶编码基因导入大肠杆菌BL21(DE3)形成一个基因工程菌从而成功构建一条以葡萄糖为底物合成D-阿拉伯醇的代谢路径，其转化率为17％。 

生物材料样品的保藏信息： 

保藏的生物材料样品：假丝酵母H2(Candida sp.H2)； 

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC)； 

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编：100101)； 

保藏日期：2009年8月28日； 

保藏登记号：CGMCC No.3255。 

附图说明