[发明专利]新基因组测序策略

说明书

技术领域

本发明涉及从头全基因组测序的有效方法。本发明涉及大规模核酸测序，特别是对生物的基因组或或其中一部分测序的方法。本发明涉及基于高通量测序技术测定优选复杂(即大)基因组的序列的改良策略。

背景技术

许多测序设计的目的是首次测定目标生物的完整基因组(从头基因组草图测序)。拥有基因组序列草图能鉴定生物的有用遗传信息，例如鉴定异种或同种不同个体之间基因改变的起源。因此，本领域对于能够以合理成本和精力从头测定个体(无论是人、动物或植物)完整基因组序列的技术有广泛的需求。这个目标通常表现为1000$-基因组，即最高耗费1000$来测定个体完整基因组序列(不考虑货币波动)。然而，实践中1000$基因组并不必定依赖于从头基因组测序和组装策略，也可基于重测序法。后一种情况下，重测序的基因组并不从头组装，但其测序得到的DNA与现存的感兴趣生物的参考基因组序列比较(或作图)。因此，重测序法技术上挑战较小，花费较少。为了清楚起见，本发明集中于从头基因组测序策略，其能用于缺乏参考基因组序列的生物。

目前的尝试各种各样，获得了多种多样和迅速增加的结果。但是，目标还未实现。以直截了当的方式对完整基因组测序和组装仍然在经济上并不可行。本领域仍然存在对于改良从头基因组测序策略的需要。

WO03/027311描述了一种克隆阵聚集鸟枪测序法(CAPPS)。该方法使用来自不同(BAC)克隆池的随机序列读数。基于该随机读数的交叉组装，可从多个克隆产生序列重叠群，并可产生相对于序列的克隆的图。该出版物更详细描述了在多维收集池，例如两维形式中BAC文库的产生，该两维形式是每个池和列含有148个BAC克隆(148x148形式)。使用CAPPS，以平均4-5X覆盖率对BAC池进行测序，在两维合并聚集方案中产生每BAC 8-10X覆盖率。在两维聚集方案中，基于在单独一列和单独池中出现的对BAC独特的序列，对每个BAC分别产生重叠群。然后，将这些BAC组装成基因组的重叠群。出版物仅基于5个BAC演示了该技术。该出版物未提及数据加工的问题。然而该技术的缺点之一是，使用随机剪切的片段需要大量读数，来以8-10倍的序列冗余水平覆盖基因组，使得该方法在大规模下非常耗力。另外，其不产生基于序列的物理BAC图。

US2007/0082358描述了一种从头组装序列信息的方法，该方法基于克隆分离和扩增的单链基因组DNA文库，使用产生有序限制性图的限制性酶，结合全基因组光学限制性作图产生完整基因组鸟枪序列信息。

US2002/0182630公开了一种通过比较亚序列的BAC重叠群作图法。该方法旨在避免与重复序列有关的困难，以及通过在重复富集的区域产生桥来生成重叠群。

以BAC为基础测定物理图谱可基于BAC文库测序(基于序列的BAC克隆物理图谱)，使用例如Keygene在WO2008/007951中描述的方法(也称作“全基因组作图”或WGP)。简单说，WGP涉及产生至少一部分基因组的物理图谱，包括步骤：从样品DNA产生人工染色体文库，聚集克隆，用限制性酶消化聚集的克隆，连接含标识物的接头，扩增连接有含标识物的接头的限制性片段，将克隆的扩增子与克隆相联并排序片段，以产生重叠群，从而建立物理图谱。

虽然在高通量测序中有许多发展，高精确测定基因组序列草图仍然被认为是昂贵和耗时的。现有方法仍需要补充，以形成产生基因组序列草图的有效且经济的方法。？特别是，目前的高通量测序技术提供了相对较短读数(直到400nt)，产生的较短重叠群难以组装成更大重叠群，并对计算能力提出高要求。

发明概述

本发明人发现，将基于克隆的基因组作图与使用高通量测序技术的样品(基因组)DNA的(高通量)测序结合起来，为高效迅速测定基因组序列草图提供了卓越的策略。通过从测序读数产生重叠群，并将这些读数锚定在全基因组作图所得的BAC(或YAC或任何其它大插入克隆载体)-重叠群中，产生长度和密度都有所提高的重叠群。因此，获得了一种基因组序列草图，其通过较少的重叠群生成，从而提高了其质量。

定义

群聚：术语“群聚”意味着在相同或相似核苷酸的短或长区段的存在下，比较两个或多个核苷酸序列，并基于相同或类似序列的短(或长)区段将具有某最小水平序列同源性的序列集合在一起。

比对：将多个序列以表格形式放置，以尽可能，例如通过引入缺口获得比对中不同序列之间的相同序列区域。本领域中已知几种核苷酸序列的比对方法，在下文中进一步详述。