[发明专利]免疫球蛋白糖基化模式分析

权利要求书

1.确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白、或它们的变体的糖基化模式的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段；

b)通过反相高效液相色谱法分离通过酶消化获得的所述免疫球蛋白的片段；

c)对步骤b)中获得的分离的所述免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及

d)从步骤c)中获得的质谱数据确定所述免疫球蛋白的糖基化模式。

2.确定IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白的Fab2片段的糖基化模式的方法，其包括以下步骤：

a)通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段；

b)用甲酸和还原剂处理步骤a)的所述酶消化的免疫球蛋白；

c)通过反相高效液相色谱法或尺寸排阻色谱法分离获得的所述免疫球蛋白的片段；

d)通过直接输注至质谱仪，对步骤b)中获得的分离的所述免疫球蛋白片段进行质谱分析；以及

e)从步骤c)中获得的质谱数据确定所述Fab2片段的糖基化模式。

3.产生IgG1或IgG2或IgG4亚类的人或人源化免疫球蛋白、或IgG2a或IgG2b或IgG3亚类的鼠免疫球蛋白的Fab₂片段或Fab片段的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)提供从其中获得Fab₂片段或Fab片段的免疫球蛋白；

b)通过用酶IdeS酶消化，将所述免疫球蛋白切割为Fab₂片段和HC-FC片段；

c)如果欲产生Fab片段，则用甲酸和还原剂处理步骤b)的所述酶切割的免疫球蛋白；

d)通过使用步骤b)或c)中获得的片段的A蛋白色谱树脂的色谱法产生所述Fab2片段或所述Fab片段。

4.监测样本的方法，其包括以下步骤：

a)储存样本一段时间；

b)通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段；

c)通过反相高效液相色谱法分离通过酶消化获得的所述免疫球蛋白的片段；

d)用甲酸和还原剂处理步骤c)的所述酶切割的免疫球蛋白；

e)通过反相高效液相色谱法或尺寸排阻色谱法分离获得的所述免疫球蛋白的片段；

f)通过与用步骤b)至e)处理的参考样本相比较的片段保留时间的位移，确定降解产物的存在。

5.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述分离步骤是：

通过尺寸排阻色谱法对获得的所述免疫球蛋白的片段脱盐。

6.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述切割步骤：

通过用酶IdeS酶消化将所述免疫球蛋白切割为片段，并用羧肽酶B处理所述免疫球蛋白。

7.根据前述权利要求任一项的方法，特征在于所述方法在所述切割步骤之后和所述纯化步骤之前包括以下步骤：

用甲酸和还原剂处理所述酶切割的免疫球蛋白。

8.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述切割在pH 5.5至pH 8.5的pH范围内进行。

9.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述切割进行2小时。

10.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述还原剂是三(2-羧基乙基)-膦。

11.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于IdeS与免疫球蛋白分子的摩尔比是1∶25至1∶2500之间。