[发明专利]基于RNAi的选择系统

权利要求书

1.一种选择包含导入的表达载体的宿主细胞的方法，包括如下步骤：

a)提供宿主细胞群，其中所述宿主细胞内源性表达至少一种细胞存活必需基因；

b)将表达载体导入所述宿主细胞，其中所述表达载体包含至少一种编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物；

c)在选择性条件下培养宿主细胞，其中所述选择性条件包括至少导入至少一种RNAi诱导化合物至所述宿主细胞，其中所述RNAi诱导化合物至少靶向由所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具有至少一个以下特征：

a)至少一种在选择性生长条件下存活的宿主细胞被选择；和/或

b)没有有效整合表达载体的宿主细胞在选择性培养条件下不存活；和/或

c)所述选择性培养条件包括导入至少另一种RNAi诱导化合物，所述RNAi诱导化合物靶向所述宿主细胞内源性表达的第二细胞存活必需基因。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表达载体具有至少一个以下特征：

a)所述编码产物的重组多核苷酸是RNAi可选择标记基因，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物；和/或

b)其包含另一个编码产物的重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述第二细胞存活必需基因的产物的功能性变体或功能性等同物；和/或

c)其包含编码感兴趣产物的另一重组多核苷酸；和/或

d)至少一种重组多核苷酸包含在表达盒中；和/或

e)至少一种重组多核苷酸包含在表达盒中，其中所述表达盒包含至少一个如下元件：

i.在所述宿主细胞中有功能的启动子和/或增强子序列；

ii.转录终止信号；

iii.多聚腺苷酸位点；

iv.内含子；

v.分泌前导序列；

和/或

f)其包含至少一个复制起点；和/或

g)其包含至少一个附加的可选择标记基因；和/或

h)编码产物的所述重组多核苷酸对用于选择的RNAi诱导化合物有抗性，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物。

4.如权利要求1到3所述的方法，其特征在于，所述RNAi诱导化合物具有一个或多个如下特征：

a)所述RNAi诱导化合物并不靶向编码产物的所述重组多核苷酸，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物，；和/或

b)所述RNAi诱导化合物靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的非翻译区；和/或

c)所述RNAi诱导化合物靶向所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因的非翻译区，该非翻译区不存在于编码产物的重组多核苷酸中，所述产物对应于和/或是所述宿主细胞内源性表达的所述细胞存活必需基因编码的产物的功能变体或功能等价物；和/或

d)所述RNAi诱导化合物选自下组：

i.其是siRNA、miRNA或shRNA；和/或

ii.其是优选18-30nt的siRNA双链分子；和/或

iii.其被载体表达。

5.如权利要求1至4所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞具有至少一个如下特征：

a)其是真核宿主细胞；

b)其是昆虫细胞；

c)其是哺乳动物细胞。