[发明专利]新表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种载体及其用途，该载体是能够在属于库克菌属的微生物中复制的穿梭载体，并且可以在属于库克菌属的微生物中诱导表达外来基因。

发明背景

使用微生物来生产有用的物质诸如工业材料的方法一般具有低能量消耗和废物产生较少的特征。因此，最近数年中随着担忧资源耗竭和诸如CO₂等排放对环境的影响，需要开发通过利用微生物的功能来生产有用物质(生物过程)的技术来作为环境调和型循环产业系统中的基础制备技术平台。

为了构建化学工业中的不依赖于化石资源或低环境负荷型的生产方法，需要以碳中和为最终目标，构建包括生物精炼(bio-refinery)在内的生物质来源的化学品生产系统。为了实现这点，数项技术突破是必要的，特别地，有必要扩大使用微生物细胞的生物过程的使用范围和应用范围，所述微生物细胞适合于自然资源再生。目前，生物过程基本上在水系反应位点(reaction site)进行，并且由于可生产的对象(化学品)较为有限，这显著缩小了生物过程的应用范围。虽然水系反应位点适合于亲水性物质的转化和生产，但是它不适合于占化学品的大部分的疏水性物质的转化、反应、或生产。

因此，需要如下技术：该技术用于设计在最适的反应位点中生产目的化学品、自由地协调最适的酶基因和宿主细胞的生物催化剂或微生物工厂。很少有涉及在含有有机溶剂的非水系反应场所中微生物反应功能的研究，工业生产的实例也较少。作为实际上可以用于有机溶剂中的微生物转化反应的微生物，有从在有机溶剂中保持细胞结构的观点来搜索得到的微生物嗜根库克菌(Kocuria rhizophila)NBRC 103217，而且其遗传信息已经得到阐明(非专利文件1)。然而，包括微生物耐久性(durability)的机制的许多部分是未知的。

为了构建在非水系反应场所中更具耐久性的微生物工厂或生物催化剂，有必要阐明耐久性机制，并且基于所述机制平行地设计宿主细胞。

在另一方面，聚焦于酶反应，为了构建有成本竞争力的生产方法，从便宜的原料生产昂贵的附加值高的产物的反应是最为重要的因素，并且需要催化此类反应的酶。此外，在多种化学品的生产步骤中，还需要实用的酶，其催化对于制造在转化成具有更高价值的化学品的过程中所必需的官能团有用的反应。从便宜的原料生产昂贵产物的反应包括碳-碳键合反应。例如，认为使用便宜的低分子量化合物诸如醛作为原料通过醛缩酶经由碳-碳键合来进行高分子化的反应和通过固定便宜的碳酸气体来进行高分子化的反应(碳酸固定反应)是有用的。

此外，在生产多种化学品时，可用于生产对于转化成那些化学品必需的官能团的反应包括例如碳的氢氧化反应和加氧反应。在这些反应中，因为在大多数情况中实质上使用不溶于水的化学物质诸如碳氢化合物作为原料，所以有必要在非水系反应场所中实施反应，而且可以在非水系统中使用的酶变为必需。然而，耐有机溶剂性与酶之间的关系(包括三维结构)尚不清楚，并且需要通过使用迄今为止获得的耐有机溶剂性酶(例如腈水解酶)作为模型，并观察其三维结构和由突变引起的耐有机溶剂性的变化来阐明所述关系。

因而，为了微生物反应在非水系反应场所中顺利的进行，期望开发能够在即使处于非水系统中也保持细胞结构的微生物中表达期望的外来蛋白质(耐有机溶剂的酶)的载体。

现有技术文件

非专利文件

非专利文件1 J.Bacteriol.Vol.190，p 4139-4146，2008.

发明内容

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述情况而开发的发明。本发明的目的在于提供一种载体，该载体是在属于库克菌属(Kocuria)的微生物中可复制的穿梭载体，而且在属于库克菌属的微生物中能够诱导表达外来蛋白质。

解决问题的方法

为了解决上文所提及的问题，本发明人构建了一种使用嗜根库克菌(Kocuria rhizophila)NBRC 103217菌株作为宿主的转化系统，所述嗜根库克菌NBRC 103217菌株在多种有机溶剂中保持其细胞结构，而且基本无蛋白质的漏出。

首先，测定嗜根库克菌NBRC 103217基因组的全碱基序列(2.7Mb)，并从该碱基序列进行2356个ORF的推定。基于这些ORF的信息，预测最适合于翻译的SD序列的上游和下游序列。