[发明专利]产生C4二羧酸的方法

权利要求书

1.一种分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸包括选自由以下组成的组的序列：

编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列；

与所述编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；和

在严格条件下与所述与所述编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列完全互补的核苷酸序列杂交的序列，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC。

2.如权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，所述多核苷酸还包括与所述多核苷酸序列可操作地连接的启动子。

3.如权利要求1或权利要求2所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述编码包括SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

4.一种载体，所述载体包括权利要求1-3中任一项所述的分离的或重组的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的载体，其中所述多核苷酸序列选自由开放阅读框、编码反义RNA的序列和编码干扰RNA的序列组成的组。

6.一种载体，所述载体包括：

启动子；和

用于表达根霉属(Rhizopus)来源的丙酮酸羧化酶蛋白的元件。

7.如权利要求6所述的载体，其中用于表达所述丙酮酸羧化酶蛋白的所述元件包括SEQ ID NO：1。

8.如权利要求6或权利要求7所述的载体，其中用于表达所述丙酮酸羧化酶蛋白的所述元件包括编码SEQ ID NO：2的多核苷酸序列。

9.如权利要求6-8中任一项所述的载体，其中所述丙酮酸羧化酶是米根霉(Rhizopus oryzae)来源的。

10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求6-9中任一项所述的载体。

11.如权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是选自由以下组成的组的属的：根霉属、酵母属(Saccharomyces)、链霉菌属(Streptomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、曲霉属(Aspergillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、棒状菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、变形菌属(Proteus)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)和肠球菌属(Enterococcus)。

12.如权利要求10或权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌。

13.如权利要求10-12中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是曲霉属的。

14.一种产生C4二羧酸的方法，所述方法包括：

在培养基中培养用选自由以下组成的组的序列转化的重组细胞：SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：1的全长互补序列；与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性且编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的序列；编码包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的序列；和编码具有丙酮酸羧化酶活性的多肽的多核苷酸的序列，其中该多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：1的全长互补序列在严格条件下杂交，所述严格条件包括65℃下0.2×SSC；和

从所述培养基回收所述C4二羧酸。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述重组细胞是选自由以下组成的组的属的：根霉属、酵母属、链霉菌属、毕赤酵母属、曲霉属、乳杆菌属、大肠杆菌、棒状菌属、短杆菌属、假单胞菌属、变形菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、欧文氏菌属、黄单胞菌属、黄杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串珠菌属和肠球菌属。

16.如权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述重组细胞是丝状真菌。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述丝状真菌是曲霉属。