[发明专利]使用嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶变体产生麦芽四糖糖浆

说明书

优先权

本申请要求美国临时专利申请系列号61/168,437的优先权，所述美国临时专利申请于2009年4月10日提交，并且在此整体引入作为参考。

序列表

本申请附有序列表，包括SEQ ID NOS：1-4，其整体引入作为参考。

技术领域

来自嗜糖假单胞菌(PSEUDOMONAS SACCHAROPHILA)的变体α-淀粉酶和编码其的核酸可以用于例如生产麦芽四糖(G4)糖浆。

发明背景

麦芽四糖(G4或DP4)糖浆是来自淀粉的酶促处理的许多商业上重要的产物之一。植物淀粉特别是玉米淀粉至麦芽四糖和低级糖例如葡萄糖或麦芽糖的转换是快速扩大的工业。

目前过程由2个顺次酶催化的步骤组成，这导致葡萄糖或麦芽糖产生。第一个酶催化的步骤是淀粉液化作用。一般地，淀粉悬浮液通过快速加热至约85℃或更高进行糊化。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)用于将粘性液化产物(liquefact)降解为麦芽糖糊精。α-淀粉酶是内切水解酶，催化内部a-1，4-D-糖苷键的随机断裂。随着a-淀粉酶对淀粉的分解，粘度下降。因为液化作用一般在高温进行，所以热稳定的α-淀粉酶例如来自芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的α-淀粉酶优选用于这个步骤。

第二个酶催化的糖化步骤需要分解麦芽糖糊精。葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶通常用于催化在液化作用后形成的麦芽糖糊精的非还原末端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。脱支酶例如支链淀粉酶可以用于帮助糖化。糖化一般在酸性条件下在升高温度例如60℃，pH 4.3发生。

与蔗糖糖浆比较，G4(也称为DP4)糖浆具有许多有利性质。例如，在食物中用G4糖浆部分地替换蔗糖可以减少食物的甜味，而不影响其味道或香味。G4糖浆在食物中具有高保水性，并且由于其较低的葡萄糖和麦芽糖含量，显示较不有害的美拉德(Maillard)反应产物。G4糖浆还具有比蔗糖更高的粘度，从而改善食物质地。与蔗糖或高果糖糖浆相比，G4糖浆较少地降低水的冰点，因此G4糖浆可以更好地控制冷冻食品的冰点。在摄入后，与蔗糖相比，G4糖浆还较少地影响渗透压。总之，这些品质使得G4糖浆理想地适合作为食物和医学产品中的成分。G4糖浆在其他工业中也是有用的。例如，G4糖浆赋予光泽并且可以有利地用作纸张施胶剂。参见例如Kimura等人，“Maltotetraose，a new saccharide of tertiary property，”Starch 42：151-57(1990)。

嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)表达有用的G4形成淀粉酶。嗜糖假单胞菌G4形成淀粉酶在本领域有多种名称，称为嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶、“Amy3A”、“PSA”、“SAS”或“PS4”。SAS和PS4在本文中可互换使用。编码PS4的核苷酸序列已得到测定。参见Zhou等人，“Nucleotide sequence of the maltotetraohydrolase gene from Pseudomonas saccharophila，”FEBS Lett.255：37-41(1989)；GenBank登记号X16732。PS4作为具有N末端21残基信号肽的前体蛋白质表达。PS4前体的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中显示。切割信号肽，形成包含530个氨基酸残基的成熟形式的PS4。成熟形式具有在N末端的催化结构域和在C末端的淀粉结合结构域。PS4的C末端淀粉结合结构域可以被去除，留下具有SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列的PS4的催化活性部分。PS4展示内切和外切α-淀粉酶活性。虽然内切α-淀粉酶活性对于降低糊化淀粉的粘度是特别有用的，但外切α-淀粉酶活性对于将麦芽糖糊精分解为更小糖类例如G4是特别有用的。

G4形成淀粉酶例如斯氏假单胞菌(P.stutzeri)G4形成淀粉酶可以在将液化淀粉转换为麦芽四糖的连续工艺中使用。在此工艺中，G4形成淀粉酶可以连同支链淀粉酶一起固定化。参见例如，Kimura等人，“Continuous production of maltotetraose using a dual immobilized enzyme system of maltotetraose-forming amylase and pullulanase，”Biotech.Bioeng’g 36：790-96(1990)。连续反应工艺的有用性受到固定化的G4形成淀粉酶的温度依赖性半衰期的限制。参见上引文。