[发明专利]控制植物害虫的方法和组合物

说明书

发明领域

本发明涉及分子生物学的领域。提供了编码杀虫蛋白质的新基因。这些蛋白质及编码它们的核酸序列可用于制备杀虫制剂和产生转基因抗虫植物。

发明背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它产生晶状包含体的能力，其中所述的晶状包含体特异性毒害某些目和种的昆虫，但是对植物和其他非靶向的生物无害。出于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白质的组合物可以作为环境可接受的杀虫剂用来控制农业昆虫害虫或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目、双翅目和鞘翅目幼虫的强力杀虫活性。这些蛋白质也显示出针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亚纲(Acari)害虫目以及其他无脊椎动物如线形动物门(Nemathelminthes)、扁形动物门(Platyhelminthes)和Sarcomastigorphora的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.在Advanced Engineered Pesticides中，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白质起初主要基于它们的杀昆虫活性分类为CryI至CryV。主要类型是鳞翅目特异性(I)、鳞翅目与双翅目特异性(II)、鞘翅目特异性(III)、双翅目特异性(IV)和线虫特异性(V)与(VI)。所述蛋白质进一步划分成亚家族；赋予每个家族内部更高度相关的蛋白质区分字母如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。每个部分内部甚至更密切相关的蛋白质给予名字，如Cry1C1、Cry1C2等。

基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶专一性，最近描述了Cry基因的一种新命名法(Crickmore等人.(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在这种新分类中，每种毒素赋予一个独特名称，包含初阶(阿拉伯数字)、次阶(大写字母)、三阶(小写字母)和四阶(另一个阿拉伯数字)。在这个新分类法中，罗马数字已经更换为初阶中的阿拉伯数字。序列同一性小于45％的蛋白质具有不同的初阶，并且次阶和三界的标准分别是78％和95％。

晶体蛋白不显示杀昆虫活性直至它在昆虫中肠中被摄取和溶解。摄取的前毒素由昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性有毒分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。这种毒素与靶幼虫中肠中的顶部刷状缘受体结合并插入顶膜，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由以希腊钥匙构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“薄卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。

除δ-内毒素外，还有若干其他已知种类的杀虫蛋白毒素。VIP1/VIP2毒素(参阅例如，美国专利5,770,696)是二元杀虫毒素，其通过这样的机制在昆虫上显示强大活性：相信其参与受体-介导的内吞作用，然后参与细胞毒化作用，这与其他二元(“A/B”)毒素的作用方式类似。A/B毒素，如VIP、C2、CDT、CST或炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)水肿和致死毒素最初通过“B”组分作为单体特异的受体介导的结合而与靶细胞相互作用。这些单体然后形成同型七聚体。“B”七聚体-受体复合体然后作为随后结合的对接平台起作用，并允许通过受体-介导的内吞作用将酶“A”组分易位到胞质溶胶中。一旦进入细胞胞质溶胶中，“A”组分通过例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化，或提高环腺苷一磷酸(cAMP)的细胞内水平来抑制正常的细胞功能。参阅Barth等(2004)Microbiol Mol Biol Rev 68：373-402。