[发明专利]用于生产感兴趣的重组多肽的方法

说明书

发明领域

本发明涉及用于生产感兴趣的重组多肽的方法，通过所述方法获得的多肽，重组多核苷酸、表达载体、表达构建体，以及特定信号肽用于生产感兴趣的重组多肽的用途和编码所述特定信号肽的多核苷酸用于生产感兴趣的重组多肽的用途。

发明背景

丝状真菌宿主细胞中重组多肽的生产是本领域已知的。目前多肽的生产以多种方式进行。

用于生产重组多肽的现有技术方法是通过发酵包含表达构建体的宿主细胞进行的，所述表达构建体包含与编码感兴趣的多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子等等。为了将感兴趣的多肽导向宿主细胞的分泌途径，感兴趣的多肽包含信号序列。在Broekhuijsen et al(Journal of Biotechnology，31(1993)135-145，Broekhuijsen et al；Secretion of heterologous proteins by Aspergillus niger：Production of active human interleukin-6 in a protease deficient mutant by KEX2-like processing of a glucoamylase-hIL6 fusion protein)中，使用分泌型多肽葡糖淀粉酶的信号序列在Aspergillus niger中表达重组蛋白质。

在工业背景下，需要生产的多肽的高产量。

可以通过提高分泌效率来增强感兴趣的重组多肽的生产产量。

因此，为了增强感兴趣的多肽的生产产量，需要改进分泌效率。

本发明的一个目的是提供改进的用于生产重组多肽的方法。

附图说明

图1描绘了表达载体pGBFINFUA-1(描述于WO2008/000632中)的质粒图谱。pGBFINFUA-1对于质粒pGBFINFUA-3和pGBFINFUA-21来说也是代表性的。相对于amyB启动子序列和编码引入了变体信号序列的α-淀粉酶的A.niger amyB cDNA序列，标出了glaA侧翼区。转化A.niger菌株之前，可以通过用限制性酶NotI消化来去除E.coli DNA。

图2描绘了表达载体pGBFINFUA-6(构建描述于实施例1中)的质粒图谱。pGBFINFUA-6对于质粒pGBFINFUA-8、pGBFINFUA-11、pGBFINFUA-12、pGBFINFUA-13、pGBFINFUA-15、pGBFINFUA-16和pGBFINFUA-18来说也是代表性的。相对于glaA启动子和编码引入了变体信号序列的α-淀粉酶的A.niger amyB cDNA序列，标出了glaA侧翼区。转化A.niger菌株之前，可以通过用限制性酶NotI消化来去除E.coliDNA。

图3描绘了通过单同源重组整合的图示。表达载体包含可选择的amdS标记物，和与amyB基因连接的启动子，所述启动子含有变体信号序列。这些特征侧翼是指导在基因组glaA基因座处整合的glaA基因座的同源区(分别为3’glaA和3”glaA)。

图4描绘了表达不同amyB构建体的A.niger菌株培养液中的α-淀粉酶活性，所有amyB构建体均位于glaA启动子的控制下。描绘了表达amyB构建体的A.niger菌株发酵液中的α-淀粉酶活性，其中不同构建体中的信号序列已被修饰。关于不同构建体的细节可见表1。以相对α-淀粉酶单位[AU]为单位描述α-淀粉酶活性，其中第3天FUA6组3个菌株的FUA-6单拷贝菌株的均值被设为100％。对指出的所有转化体组而言，分离并独立培养三个转化体。

图5描绘了表达两种不同的amyB构建体的A.niger菌株培养液中的α-淀粉酶活性，所述两种不同的amyB构建体均位于amyB启动子的控制下。描述了表达天然amyB构建体(pGBFINFUA-3)的A.niger菌株发酵液中的α-淀粉酶活性，其中根据本发明的方法将amyB信号序列修饰成了经密码子优化的pmeA信号序列(pGBFINFUA-21)。关于两种构建体的细节可见表2。以相对α-淀粉酶单位[AU]为单位描述α-淀粉酶活性，以第3天FUA3组3个菌株的FUA-3-1单拷贝菌株的均值设为100％。对指出的两个转化体组而言，分离并独立培养三个转化体。