[发明专利]用于冷冻干燥乳酸菌的冷冻保护剂

说明书

本发明涉及冷冻保护剂的新型组合的用途，其用于增加经冷冻干燥后的乳酸菌的存活力、改善冻干的块(cake)的质感以易于研磨，以及改善冷冻干燥细菌在不同温度条件下的长期稳定性。

技术领域

该项发明所涉及的领域是生产冻干细菌，特别是乳酸菌。更具体地，本发明涉及冷冻保护剂的新型组合的用途，其用于增加经冷冻干燥后的细菌的存活力、改善冻干的块的质感以易于研磨，以及改善冷冻干燥的细菌在不同温度条件下的长期稳定性。本发明还涉及此类冷冻干燥的细菌，其用于食品工业或用于人类或动物的健康应用。更具体地，本发明涉及重组细菌的提高的存活力和长期贮存能力，所述重组细菌能表达异源蛋白或肽，并以治疗或疫苗接种的目的向人类或动物施用。

发明背景

乳酸菌(LAB)是一组在分类学上多样的革兰氏阳性细菌，它们能够将可发酵的碳水化合物主要转换成乳酸，从而在该过程中酸化生长培养基。通常，乳酸菌(LAB)种类在食品工业中的用途最为知名，其主要是用于制备发酵食物诸如乳制品和某些肉类。乳制品发酵工业的商业重要性涵盖了例如奶酪、酸乳酪和酸奶油的生产，这些都是世界公认的。

在过去的几十年里，人们对乳酸菌(LAB)的兴趣已显著提高。特定乳酸菌(LAB)菌株能影响肠道生理的这一事实已广泛受到认同。人们对于乳酸菌用作异源蛋白的生产宿主，并最终用作生物活性分子的就地生产和递送系统的兴趣日益增加(见下文)。

目前，研究人员倾注了大量的精力来研究基因改造的(GM)乳酸菌物种用作局部、粘膜给药的生物药物(包括细胞因子、抗体片段、生长因子、激素和神经肽)的生产和递送工具的用途。(例如[6-12])。更具体地，经改造的食品级细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis(L.lactis))被选为用于治疗性递送生物活性多肽的优选微生物。显然，经改造的乳酸乳球菌菌株用于递送口服治疗性蛋白质的这一概念创造了激动人心的可能性。然而，任何医药产品的一个必要属性是长期稳定性(保质期)，在预定的贮存条件下通常为至少24个月。为此，需要为基于经改造的乳酸乳球菌的药物物质(DS)和药物产品(DP)制剂开发一个高效且具伸缩性和可靠性的制造平台。

在制造和后续的贮存期间，产品稳定性的关键参数是经改造的细菌的长期存活力(通常表示为菌落形成单位(CFU)/克，作为贮存时间的函数)。乳酸乳球菌菌株的生产、贮存和最终的治疗使用会对细菌带来显著的压力[4]。在工业环境中，乳酸菌(LAB)可以以液体、喷雾干燥、冷冻或冻干(冷冻干燥)的形式被保存和分配。虽然上述所有制备物都适合用作食品工业中的起始培养物(starter culture)，但现在已越来越重视促进高细胞活力和代谢活性的长期保存方法，这是因为这些参数被认为是(生物)药物应用的先决条件。为了最大限度地提高存活能力，向生物质添加所选定的冷冻保护剂以及后续的冻干是关键步骤，特别是考虑到存活的且具有代谢活性的细菌是诱导期望的原位治疗效果的绝对要求这一事实。

冷冻干燥被广泛视为是最适合的细菌脱水过程之一，其目的旨在获得固体的和稳定的最终制剂[4]。其是用于贮存微生物细胞培养物的最常见方法之一，即使冷冻干燥后及贮存过程中的存活率可能因不同菌株而有所不同[5]。冷冻干燥后的存活率反映了细胞抵抗快速冷冻和干燥的影响(例如在数个靶位点处的膜脂质氧化和细胞损伤)的能力[5]。众所周知，大多数无保护的细菌在冷冻干燥后都会被杀死，而存活的那些在进行贮存时迅速死亡。因此，已进行了多种尝试来增加冻干和贮存后存活的细菌的数量，但仅取得有限的成功(见下文)。

冷冻干燥是迄今为止最频繁(如果不是唯一的话)用于实现长期保质期的方法[16]。选择适当的干燥介质/冷冻保护剂混合物是增加乳酸菌(LAB)在冻干和后续贮存过程中的存活率的关键因素[4]。已报告了试图增加乳酸菌(LAB)在冻干和/或后续贮存过程中的存活率的几项研究(关于综述，参见[4])。然而，这些出版物都未证明冻干细菌具有足够的长期稳定性(即一年后能达到＞80％的存活率)，特别是在室温(25℃)或2-8℃下，如制药应用所需要的。

对于大多数对乳品行业具商业利益的乳酸菌(LAB)培养物而言，脱脂奶粉被选为干燥介质，因为它能够稳定细胞膜的成分、有利于再水化并且形成一层细胞保护膜[4]。补充了额外的冷冻保护剂的脱脂乳可提高其内在的保护作用。