[发明专利]通过发酵条件改变酶平衡

说明书

I、相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年4月30日提交的美国临时申请号61/174,460的权益。

II、技术领域

本教导内容涉及改善的蛋白质从细胞培养物的生产的方法，特别涉及可优选的增加从处于木聚糖酶基因启动子序列控制下的基因生产的蛋白质表达的培养组分和条件。改善的方法可用于生产具有增强的木聚糖酶和半纤维素水解活性的纤维素酶组合物。

III、简介

生物质的主要组分是纤维素和半纤维素。纤维素由组织成更有序的原纤维结构的β-1，4-连接的葡萄糖残基的聚合物组成。木聚糖在植物细胞壁中几乎与纤维素一样普遍，主要含有如纤维素中连接的β-D-木糖单位。一些木聚糖含有其他糖类，例如L-阿拉伯糖，但其形成分支，而不是主链的一部分。

纤维素和半纤维素可以转化为糖，例如葡萄糖，并出于工业目的被多种微生物用作能源，所述微生物包括细菌、酵母和真菌。纤维素物质还可以被可商购的酶转化为糖，所获得的糖可用作工业微生物的原料，来生产产品，例如塑料和乙醇。丝状真菌——里氏木霉(Trichoderma reesei)，是纤维素酶的有效生产者。已探索了此类里氏木霉生产这些酶的能力。然而，现有的纤维素酶产品一般缺少完全水解半纤维素物质的能力，其中一些半纤维素物质在生物质组合物中仍然是未消耗的，并可能干扰生物质的处置和处理。

里氏木霉蛋白质的纤维素水解混合物是微生物的最有特色的纤维素水解通路之一。包含这些混合物的纤维素酶分为两大主类：内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)。β-葡糖苷酶(BGL)也是里氏木霉的纤维素酶混合物的一部分。

在转录水平协调和调控包含纤维素酶系统的基因的表达。该系统的成员协同作用，并且如上所述，是纤维素有效水解为可溶性寡糖所必需的。

木霉中主要纤维素酶基因(cbh1，cbh2，egl1和egl2)和木聚糖酶基因(xyn1，xyn2和xyn3)的表达和生产依赖于生长可利用的碳源。纤维素酶基因受葡萄糖的严密抑制，并可以被纤维素或二糖槐糖(sophorose)诱导数千倍。实际上，相比含有葡萄糖的培养基，在含有诱导性碳源(例如纤维素或槐糖)的培养基上，主要的纤维二糖水解酶1(CBH1)的表达水平被上调数千倍(Ilmen等人，App.Environ.Microbio.，1298-1306，1997)。

三种主要类型的木聚糖酶(xyn1，xyn2和xyn3)不是共调控的。研究已显示，xyn1和xyn2的表达以不同的方式调控，即，在存在木聚糖和木糖的条件下诱导xyn1，槐糖轻微的诱导xyn1，而xyn2则非特异性的同时受木聚糖酶和纤维素酶诱导物的影响(Zeilinger等人，1996；March等人，1996，Xu等人，1998)。第三种木聚糖酶xyn3则完全不受该酶的底物——木聚糖的诱导，而受纤维素及其衍生物的诱导(Xu等人，Appl Microbiol Biotechnol.2000.54：370-375，Furukawa，Fungal Genetics and Biology.2008.45：1094-1102)。此外，高浓度的葡萄糖已知抑制xyn1的表达。因而，本公开内容展现了令人惊讶的发现，即加工的葡萄糖和木糖诱导纤维素酶和木聚糖酶的表达，即使本领域已知葡萄糖和木糖不利于纤维素酶和木聚糖酶的活性。

现有的混合纤维素酶产品缺少水解半纤维素物质的优化系统。所需要的是共同生产或混合优化组合的酶，所述酶组合能够降解生物质底物的纤维素的和半纤维素的组分。对产生纤维素酶和木聚糖酶的平衡混合物的商业实践方法也存在进一步的需求。

IV、概述

现已发现将转糖基化酶在升高的温度下孵育在浓缩的葡萄糖溶液中产生加工的葡萄糖溶液，当与戊糖(例如木糖)组合时，产生能够诱导表达平衡的纤维素水解和半纤维素水解的酶掺合物的混合的糖类组合物。令人惊讶的是，所获得的混合的糖类组合物足以诱导纤维素酶和木聚糖酶的生产，而不需要进一步的纯化。该发现令人惊讶之处在于葡萄糖在里氏木霉中作为纤维素酶和某些木聚糖酶基因的阻抑物发挥作用。该发现提供了纤维素酶和半纤维素酶基因表达的诱导物，是纯化的糖类诱导物和纤维素酶和木聚糖酶分离生产的廉价替代物。

本发明的一个方面提供了制备混合的糖类组合物的方法，所述方法包括：(a)将葡萄糖溶液与转糖基化酶混合，产生酶-葡萄糖混合物；(b)在升高的温度下孵育酶-葡萄糖混合物一定时间，所述时间足以产生包含至少一种寡糖的加工的葡萄糖混合物；(c)将加工的葡萄糖混合物与戊糖混合，产生混合的糖类组合物。