[发明专利]用于免疫调节的多联体

说明书

本发明涉及一种调节人类和动物免疫系统活性的聚合的、非编码核酸分子和其制备方法以及包括所述聚合的、非编码核酸分子的疫苗，其中聚合的、非编码核酸分子可理解为非编码核酸分子，包括所述非编码核酸分子的至少四个共价结合分子(四聚体)。

在对各自病原体选择特异淋巴细胞、其克隆扩增和分化为效应细胞后，适应性免疫反应延迟(3-5天)开始，然后通过形成免疫学记忆对各自病原体提供长期持久的保护，先天性免疫系统细胞通过保守的病原体相关性分子图式(PAMP)由生殖细胞编码受体识别病原体并立即作出反应。不同的反应属于不同种类的细胞类型，如细胞因子(如IL-1、IL-6、TNF-α)和趋化因子(如IL-8/CXCL8、MIP-1α/β、MCP-1)的分泌，效应物机制的激活(吞噬作用、呼吸放电、杀菌剂或细胞毒性物质或溶解颗粒的释放)，共刺激分子(CD80，CD86)的表达和MHC-分子的增强表达。因此，一方面效应细胞被募集和激活，这能消除已进入的病原体，另一方面，适应性免疫系统细胞接收为其激活所必要的信号。

为了提高免疫反应，CpG-寡核苷酸(CpG-ODN)已被用作一类新的免疫调节分子。这种非甲基化CG-基序能在细菌DNA中发现并代表了对于免疫系统的“危险信号”。病原体相关性分子图式(PAMP)引起先天性免疫系统的非特异性激活(Krieg，Nat.Med 2003，9：831-835)。CpG-ODN通过细胞因子白细胞介素-12、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α诱导基于T_H1的免疫反应。

包含所述CpG-ODN的免疫刺激核酸(ISS)具有若干个碱基长度以及不包括用于蛋白质表达的开放读框。

ISS表示线性核酸分子，其末端是开放的(游离羟基和磷酸基团)或由合成基团保护。

细胞免疫反应的刺激允许影响反馈环，其将不能对病人无干扰地产生令人满意的免疫活性。

可用于稳定CpG-DNA的CpC-ODN以硫代磷酸酯主链的修饰有一些严重缺陷。显著的毒性(Heikenwalder 2004，Levin 1999)和非特异性结合蛋白质(Brown 1994)特别属于该类。

由此，开发了新类型共价闭合免疫调节DNA(WO 01/07055/EP1196178)。这些DNA-分子由两个化学合成的DNA-ODN组成，在5’-端有自互补部分及在3’-末端有回文、重叠末端，使两个DNA分子的连接产生共价闭合分子。在非互补部分具有CG-基序的这些DNA-分子显示出与CpG-ODN相似的活性(增强的B-细胞上表面分子CD80、CD40、MHC的表达以及通过PBMC的IL-6、IFN-γ、IFN-α、IL-12、TNFα的分泌)，但与有硫代磷酸酯主链的CpG-ODN相比，对于诱导的细胞因子的表达模式其显示差异以及在小鼠中明显地更小毒性。现有技术中该免疫调节DNA对于人类和动物免疫系统的活性调节有若干缺陷。不可能以所希望的程度调节人类和动物免疫系统的活性，尤其是激活它。WO01/07055的分子，例如图1所示或权利要求11所示，由若干个脱氧核糖核苷酸支架组成，该脱氧核糖核苷酸支架形成部分单链哑铃型和共价闭合DNA分子，这在本发明的范围内指定为二聚体。根据WO 01/07055，用作初始材料的单体核酸在连接前被加热，接受相同的核酸分子，每一个由一哑铃型二聚体组成(对比WO 01/07055的图1)。所得的核酸是WO 01/07055图1所示的哑铃型。从本发明的意义上说，单体没有指定由例如单一碱基组成的结构，但是指定如下核酸，其本身由数个脱氧核糖核苷酸一磷酸组成(对比WO 01/07055的图1或权利要求11)，该脱氧核糖核苷酸一磷酸由于其给定的碱基序列或给定的三维构象而一起形成单体典型性能。

来自现有技术，本发明的目的是提供合适的免疫调节DNA分子，其起始改良的免疫反应及提供其制备方法和包括所述免疫调节DNA-分子的疫苗。

免疫调节在本发明文中意指免疫系统的介质和效应细胞，因此目前主要已知的有辅助功能的胸腺细胞和细胞毒性胸腺细胞、B-细胞和所谓的NK(自然杀伤)-细胞、巨噬细胞和单核细胞和树突细胞及其前体以及目前没有明确鉴别功能的在免疫系统内具有作用的细胞群通过使用核酸分子而被刺激以增殖、迁移、分化或其活性。免疫调节意指除了上述定义的含义中免疫反应的一般改良，免疫反应的类型或特征也将被影响，无论通过影响开始或成熟的免疫反应或对于已确立的反应改变其特性。