[发明专利]AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035和AXMI-045: 来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白及其用法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。本发明提供编码杀病虫害蛋白的新基因。这些蛋白质以及编码它们的核酸序列可以用于制备杀病虫害制剂和转基因抗病虫害植物的生产。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性产芽孢土壤细菌，其特征是能够产生晶状包涵体，该晶状包涵体对昆虫的某些目和种具有特异性毒性，但是对植物和其它非靶生物体无害。因此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白的组合物能够被用作环境可接受的杀虫剂，以控制农业昆虫害或多种人或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)主要对鳞翅目(Lepidopteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)昆虫的幼虫具有强效杀虫活性。这些蛋白对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨目(Acari)的害虫以及例如线形动物(Nemathelminthes)、扁形动物(Platyhelminthes)和肉足鞭毛动物(Sarcomastigorphora)等其它无脊椎动物目也显示出活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.In Advanced Engineered Pesticides，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.)。这些蛋白起初主要根据其杀虫活性被分类为CryI至CryV。主要类别为鳞翅目特异的(I)、鳞翅目和双翅目特异的(II)、鞘翅目特异的(III)、双翅目特异的(IV)、以及线虫特异的(V)和(VI)。蛋白被进一步划分为亚家族；在每个家族中更为高度相关的蛋白被配给分部字母，例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。在每一个分部中甚至更紧密相关的蛋白被命名为例如Cry1C1，Cry1C2等。

最近，提出了一个针对Cry基因的新的命名系统，该命名系统基于氨基酸序列的同源性而不是基于昆虫靶标的特异性(Crickmore等(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：807-813)。在新的分类系统中，每种毒素被指定一个唯一名称，该名称由第一等级(一个阿拉伯数字)、第二等级(一个大写字母)、第三等级(一个小写字母)和第四等级(另一个阿拉伯数字)合并而成。在新的分类系统中，以阿拉伯数字取代了罗马数字用于第一等级。序列一致性低于45％的蛋白质具有不同的第一等级，用于划分第二和第三等级的标准分别为78％和95％。

晶体蛋白在被昆虫吞食并在昆虫中肠中被溶解之前，不会显示出杀虫活性。被吞食的原毒素被昆虫消化道中的蛋白酶水解为活性毒素分子(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53：242-255)。该毒素结合到靶幼虫中肠中的顶端刷状缘受体上，并插入到顶端膜中形成离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。

δ-内毒素通常具有5个保守的序列区域和3个保守的结构域(见，例如de Maagd等(2001)Trends Genetics 17：193-199)。第一个保守的结构域由7个α螺旋组成，它涉及膜的插入和孔的形成。结构域II由排列成希腊钥匙构型的3个β折叠组成，结构域III由呈“果冻卷”形状的两个反平行β折叠组成(de Maagd等，2001，supra)。结构域II和III涉及受体的识别和结合，因此被认为是毒素特异性的决定因素。

除了δ-内毒素以外，还有7种其它已知的杀病虫害蛋白毒素类别。VIP1/VIP2毒素(见，例如美国专利5,770,696)是二元杀病虫害毒素，该毒素通过据认为涉及受体介导的内吞作用及随后的细胞毒性化的机制(这和其它二元(“A/B”)毒素的作用模式类似)，而对昆虫显示出强烈的活性。诸如VIP、C2、CDT、CST、或炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)水肿和致死毒素等A/B毒素最初通过“B”组分以单体形式的特异的、受体介导的结合，与靶细胞相互作用。这些单体随后形成同源七聚体。“B”七聚体-受体复合物随后起到一个对接平台的作用，该平台随后结合酶性“A”组分，并通过受体介导的内吞作用将“A”组分转移到细胞溶质中。一旦进入到细胞溶质中，“A”组分就会通过，例如G-肌动蛋白的ADP-核糖基化、或增加胞内环腺苷酸(cAMP)的水平，来抑制正常的细胞功能。见Barth等(2004)Microbiol Mol Biol Rev 68：373-402。