[发明专利]使用嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶变体和脱支酶的麦芽四糖浆液的改良生产

说明书

优先权

本申请要求2009年5月11日提交的美国临时申请系列号61/177,136的优先权权益，所述美国临时申请在此以其整体引入作为参考。

序列表

附上包含SEQ ID NO：1-8的序列表，并且其在此以其整体引入作为参考。

发明领域

来自嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila)的变体麦芽四糖水解酶和支链淀粉酶尤其对于从淀粉液化物(starch liquefact)产生糖浆是有用的。

背景

将植物淀粉，尤其是玉米淀粉转化为麦芽四糖和低级糖，例如葡萄糖或麦芽糖是迅速发展的工业。当前的方法由两个顺次的酶催化步骤组成，其导致产生葡萄糖或麦芽糖。第一个酶催化步骤是淀粉液化。一般地，通过快速加热至85℃或更高使淀粉悬液胶化。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)用于将该粘的液化物降解为麦芽糖糊精。α-淀粉酶是内切水解酶，其催化内部α-1，4-D-糖苷键的随机切割。随着α-淀粉酶降解淀粉，粘度下降。由于液化通常在高温下进行，热稳定的α-淀粉酶诸如来自芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的α-淀粉酶对于这一步骤是优选的。

需要第二个酶催化的糖化步骤以降解麦芽糖糊精。葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶通常用于催化液化后形成的麦芽糖糊精非还原末端的水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦芽糖。

麦芽四糖(G4或DP4)浆液是来源于酶促处理的淀粉的许多商业上重要的产品之一。G4浆液与蔗糖浆液相比较具有许多有利的特性。例如，在食物中用G4浆液部分取代蔗糖，在不影响其味道或风味的情况下降低了食物的甜度。G4浆液在食物中具有高保湿性，并且因为G4浆液更低的葡萄糖和麦芽糖含量，所以显示出更少有害的美拉德反应产物。G4浆液也具有比蔗糖更高的粘度，因此改进了食物质地(food texture)。G4浆液比蔗糖或高果糖浆液更少降低水的凝固点，因此，G4浆液可以更好地控制冰冻食物的凝固点。食入后，G4浆液也比蔗糖更少影响渗透压。总之，这些特性使得G4浆液在理论上适合于作为食物和药物产品中的成分。G4浆液也用于其他工业。例如，G4浆液赋予光泽度，并可以有利地用作为纸施胶(paper sizer)。参见，例如，Kimura等人，“Maltotetraose，a new saccharide of tertiary property，”Starch 42：151-57(1990)。

嗜糖假单胞菌表达有用的G4形成淀粉酶，其不同地称为嗜糖假单胞菌(P.saccharophila)麦芽四糖水解酶、“Amy3A”、“PSA”、“SAS”或“PS4”。在本文中SAS和PS4互换地使用。PS4展示出内切和外切α-淀粉酶活性。虽然内切α-淀粉酶活性可用于降低胶化淀粉的粘度，但外切α-淀粉酶活性可用于将麦芽糖糊精降解为更小的糖，例如G4。已经将SAS进行了大量的基因工程改造以产生对于G4浆液产生具有改进的特性的多种SAS变体。一个特定的变体，SAS3，已经显示出对于G4浆液产生的良好特性。参见，例如，WO 07/148224(Danisco A/S)。然而，由于在终产物中存在显著量的DP5+(具有5或更高的聚合度的寡糖)，因此在SAS3催化的G4浆液产生中并没有有效地使用淀粉材料。因此，仍存在改进G4浆液产生的需求，例如通过降低DP5+的量以最大化使用淀粉底物。

概述

嗜糖假单胞菌麦芽四糖水解酶(PS4)变体能在高温，例如，约60℃至约75℃，从液化的淀粉或麦芽糖糊精的其他来源中产生麦芽四糖。然而，在PS4催化的糖化的最后仍保留了显著量的高级寡糖。为了改进麦芽四糖产生的效率，在糖化期间将支链淀粉酶补充到含PS4变体的组合物中。此种组合能产生更多的麦芽四糖，例如，比仅使用PS4变体多约20％。