[发明专利]热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用

权利要求书

1.一种扩增核酸组合物中靶核酸或其部分的方法，所述方法包括：

(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：

(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，

(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，和

(iii)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；

(b)用第一内切核酸酶在切割条件下切割所述第一功能性切割位点，从而产生可延伸引物和包含所述封闭部分的片段；以及

(c)在扩增条件下延伸所述可延伸引物，从而扩增靶核酸或其部分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中包含封闭部分的片段含有可检测特征。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括检测所述可检测特征。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，其中包含封闭部分的片段含有捕获剂。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，其中第一寡核苷酸的封闭部分不同于第二寡核苷酸的封闭部分。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，其中每种寡核苷酸的封闭部分独立地选自生物素、亲和素、链霉亲和素和可检测标记。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，其中(a)、(b)和(c)在同一反应环境中进行和/或同时进行。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸中的一种包含5′区，该5′区含有：

(i)与靶核酸不互补的核苷酸亚序列，

(ii)第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分，该第二内切核酸酶切割位点的无功能性部分在扩增条件下转变成功能性第二内切核酸酶切割位点，和

(iii)可检测特征。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包含用第二内切核酸酶在切割条件下切割所述功能性第二内切核酸酶切割位点，从而产生包含可检测特征的片段。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，其中所述切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种片段。

11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，还包含检测一种或多种片段的一种或多种可检测特征。

12.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，其中一种或多种所述片段含有捕获剂。

13.如权利要求8-13中任一项所述的方法，其特征在于其中用第二内切核酸酶切割在与(a)、(b)和(c)相同的反应环境中进行和/或与(a)、(b)和(c)同时进行。

14.一种检测核酸组合物中靶核酸的方法，所述方法包括：

(a)在杂交条件下使核酸组合物与两种寡核苷酸接触，其中每种寡核苷酸包含：

(i)与靶核酸互补的核苷酸亚序列，

(ii)第一内切核酸酶切割位点的非末端无功能性部分，当所述寡核苷酸与靶核酸杂交时该第一内切核酸酶切割位点的所述部分形成功能性第一内切核酸酶切割位点，

(iii)可检测特征，和

(iv)所述寡核苷酸3′端的封闭部分；

(b)在切割条件下使核酸组合物与第一内切核酸酶接触，当存在靶核酸时，第一内切核酸酶切割所述功能性第一内切核酸酶切割位点，从而产生并释放含有可检测特征的切割产物；以及

(c)检测上否存在含有该可检测特征的切割产物，从而根据检测有无该可检测特征的切割产物确定有无靶核酸。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)在同一反应环境中进行。

16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于，其中(a)和(b)同时进行。

17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其特征在于，(b)中的切割产生含有可区分的可检测特征的2种或多种切割产物。