[发明专利]适合将免疫原性分子递送到细胞中的突变CyaA多肽及多肽衍生物

说明书

技术领域

本发明涉及适合用于将一种或更多种分子递送到细胞中的多肽。

具体而言，本发明涉及适合用于将一种或更多种能够引发免疫应答的分子，特别是通过表达CD11b/CD18受体的靶向细胞(在本文也称为“CD11b表达细胞”)递送到宿主中的多肽。

本发明更具体而言涉及得自腺苷酸环化酶蛋白质(CyaA)的多肽，腺苷酸环化酶蛋白质以毒素或解毒蛋白质或类毒素形式使用，所述多肽为突变多肽。所述突变多肽能够保留天然CyaA与靶细胞的结合活性，且优选还能够保留天然CyaA经过其N-端结构域进入靶细胞中的易位活性，并且此外其具有成孔活性，该成孔活性与天然CyaA毒素的成孔活性相比是降低的或抑制的。

本发明特别涉及所述多肽作为蛋白质载体的应用。因此，所述突变多肽进一步与非-CyaA分子结合，从而产生多肽衍生物，其中所述分子当施用给宿主时具有预防性疫苗和/或治疗益处。

本发明的多肽适合用作蛋白质载体，用于将分子，尤其是具有含一个或更多个表位特别是抗原的氨基酸序列的多肽分子递送到细胞中，特别是CD11b表达细胞中。

本发明因此还涉及多肽衍生物(本发明的突变多肽的衍生物)，其包含本发明的突变多肽或由本发明的突变多肽组成，其中所述突变多肽与一个或更多个分子，尤其是一个或更多个适合引发免疫应答的分子重组，从而构成重组多肽或融合多肽。本发明还涉及通过使所述分子与突变多肽化学接枝而获得的多肽衍生物。

根据一个实施方式，本发明的多肽衍生物适合用在预防疗法中，并且特别适合疫苗接种以及包括免疫疗法的治疗中，特别是用于在受试对象中引发免疫应答。

在本发明的上下文中使用的用于设计本发明多肽的天然CyaA是主要在博德特氏菌属(Bordetella)生物中，特别是在百日咳博德特氏菌(Bordetella Pertussis)中产生的腺苷酸环化酶，其具有下述特征和性质，其公开的目的是在本发明的上下文中表征所述蛋白质。

双功能RTX腺苷酸环化酶毒素-溶血素(于此也称为腺苷酸环化酶毒素(CyaA、ACT或AC-Hly)是百日咳博德特氏菌的关键致病因子，其是百日咳(1)的病原体。其1706个残基长度的多肽是N-端腺苷酸环化酶(AC)酶结构域或部分(～400个残基)与构成C-端部分或结构域(2)的～1306个残基的成孔RTX溶血素(在ToXin溶细胞素中重复)的融合体。后者通过共价翻译后棕榈酰化Lys⁸⁶⁰和Lys⁹⁸³的ε-氨基而包含将proCyaA活化为CyaA的位点，以及包含形成～40个钙结合部位的众多RTX重复，其装载(loading)是CyaA(3，4)的细胞毒素活性所需的。CyaA蛋白质实际上作为无活性原毒素而被合成，其通过翻译后棕榈酰化两个内部赖氨酸残基(赖氨酸860和983)而被转化为活性毒素。这种翻译后修饰要求与cyaA基因表达附加基因，即位于百日咳博德特氏菌染色体上的cyaA附近的cyaC。

毒素主要靶向表达α_Mβ₂整联蛋白受体的宿主骨髓吞噬细胞，α_Mβ₂整联蛋白受体也称为CD11b/CD18、CR3或Mac-1(5)。所述毒素具体是通过存在于其C-端部分的受体结合部位而与表达CD11b/CD18受体的细胞的CD11b/CD18受体结合。这些细胞因此是天然毒素的靶细胞，且还是本发明多肽的靶细胞。CyaA插入细胞的细胞质膜中并将AC酶结构域易位到所述靶细胞的胞质溶胶中(6，7)。在细胞内，AC被钙调节蛋白激活并催化不受控制的细胞ATP向cAMP的转化，cAMP是激发削弱吞噬细胞杀菌功能的关键第二信使分子(1)。在高剂量下(＞100ng/ml)，CyaA-催化的ATP消耗成cAMP变成细胞毒性的，并且促进凋亡甚或迅速的坏死性死亡以及CD11b⁺单核细胞的溶解(8，9)。

最近，发明人显示，CyaA结合其CD11b/CD18受体的N联寡糖(10)。这表明与普遍存在的细胞表面蛋白的葡聚糖或糖脂的低特异性相互作用可解释虽然降低了大约2个数量级，但是能够容易检测到CyaA也穿透缺乏CD11b/CD18的细胞。的确，由于AC结构域具有极其高的特异性催化活性，发现CyaA也显著升高哺乳动物和鸟类红细胞、淋巴细胞、淋巴瘤、成神经细胞瘤CHO或气管上皮细胞中的cAMP(1，11)。