[发明专利]属于细胞信号通路的细胞内生物标记物的全血含量及其测量确定细胞群的活化的用途

权利要求书

1.利用ELISA检测全血样品中预先确定的细胞群的细胞活化状态的方法，包括确定与细胞信号通路相关的细胞内蛋白(生物标记物)的磷酸化状态，所述检测对所述全血样品进行。

2.根据权利要求1所述的利用ELISA的检测方法，其中所检测的细胞活化状态是血小板的细胞活化状态。

3.根据权利要求1或2所述的利用ELISA的检测方法，其中予以磷酸化状态测试的细胞内蛋白是激酶家族的蛋白或者其是激酶底物蛋白。

4.根据权利要求2所述的利用ELISA的检测方法，其中所述细胞内蛋白是激酶的底物蛋白，或者选自激酶PKA、PKG、AKT、ERK、JAK2、BCR-ABL的激酶本身。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的利用ELISA的检测方法，其中所述细胞内蛋白是诸如蛋白VASP或STAT5的血小板激酶底物，或者其是诸如蛋白AKT、p38或ERK的激酶。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的利用ELISA的检测方法，包括对全血样品进行的以下步骤：

a)用第一化合物活化所述全血样品的等分试样，所述第一化合物通过活化预先确定的细胞内蛋白的磷酸化而作用于所述样品的预先确定的细胞群的细胞活性，有利地是生理化合物，以及用所述第一化合物和第二化合物活化另一等分试样，所述第二化合物通过与细胞受体相互作用的通路或通过与细胞信号酶相互作用的通路抑制或修饰所述磷酸化；

b)于能够在非磷酸化的细胞内蛋白和磷酸化状态的所述蛋白之间保持平衡的条件下裂解所活化的样品的细胞，所述平衡提供了所述样品的所述预先确定的细胞群的细胞活性的证据；

c)清洗以除去裂解产物；

d)将所处理的样品与捕获探针一起孵育，所述捕获探针包含特异性识别所述细胞内蛋白而与其磷酸化状态无关的抗体；

e)显示所述磷酸化的细胞内蛋白之间形成的免疫复合物，以及显示特异性识别磷酸化状态的所述细胞内蛋白的抗体；

若适当的话，标记所述抗体。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的利用ELISA的检测方法，包括在对采集自患者的全血样品进行的以下步骤，已给予所述患者通过修饰预先确定的细胞内蛋白的磷酸化而与血小板活化相互作用的化合物(称为第二化合物)：

a)用第一化合物活化所述全血样品的等分试样，所述第一化合物通过活化预先确定的细胞内蛋白的磷酸化而作用于所述样品的预先确定的细胞群的细胞活性；

b)于能够在非磷酸化的细胞内蛋白和磷酸化状态的所述蛋白之间保持平衡的条件下裂解所活化的样品的细胞，所述平衡提供了所述样品的所述预先确定的细胞群的细胞活性的证据；

c)清洗以除去裂解产物；

d)将所处理的样品与捕获探针一起孵育，所述捕获探针包含特异性识别所述细胞内蛋白而与其磷酸化状态无关的抗体；

e)显示所述磷酸化的细胞内蛋白之间形成的免疫复合物，以及显示特异性识别磷酸化状态的所述细胞内蛋白的抗体；

若适当的话，标记所述抗体。

8.根据权利要求6所述的方法，其中用所述第二化合物活化先于用所述第一化合物活化。

9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，在步骤a)中，用抑制或修饰磷酸化的所述第二化合物活化，是要测试其对细胞活性的影响的物质，例如具有生物学活性或治疗活性的物质。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的利用ELISA的检测方法，其中所述清洗步骤之后是冷冻步骤，以保存样品。

11.根据权利要求6-10中任一项所述的利用ELISA的检测方法，其中显示所述形成的免疫复合物是用抗体标记物的底物进行的，并且包括测量所处理样品的两个等分试样的光密度的步骤，之后若适当的话，确定PRI。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的检测方法，其中予以磷酸化状态确定的所述细胞内蛋白是VASP蛋白，并且予以活化确定的所述细胞群是血小板群，用第一化合物活化的样品的等分试样，所述第一化合物是VASP磷酸化的激动剂，用相同的第一化合物以及进一步用第二化合物活化的样品的另一等分试样，所述第二化合物与予以生物学活性或治疗活性测试的物质的靶血小板受体相互作用。