[发明专利]分析肽混合物的方法

说明书

相关申请

本申请要求2009年5月8日提交的申请序号61/176,579的美国临时专利的优先权。

技术领域

本发明涉及通过质谱法表征、比较和归类肽类、肽混合物、多肽混合物和包括多肽组分的生物分子的分析方法。更特别地，本发明提供一种表征和归类包括几种不同氨基酸的复合肽混合物、多肽混合物或包括多肽组分的生物分子的分析/统计方法。

背景技术

共聚物-1为一种通过聚合氨基酸谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸而制备的复合多肽混合物。共聚物-1被称为乙酸格拉默，具有下述结构式：

(Glu，Ala，Lys，Tyr)χ·χCH₃COOH

(C₅H₉NO₄·C₃H₇NO₂·C₆H₁₄N₂O₂·C₉H₁₁NO₃)χ·χC₂H₄O₂{Physician Desk reference，(2000)}

乙酸格拉默(GA)是克帕松(COPAXONE)(Teva Pharmaceutical Industries Ltd.，以色列)的活性成分，其包括含有四种天然氨基酸：L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸(具有的平均摩尔数分别为0.141、0.427、0.095和0.338)的合成多肽混合物的乙酸盐。克帕松的平均分子量为4,700至11,000道尔顿。乙酸格拉默是一种治疗多发性硬化症(MS)的批准药物。乙酸格拉默的制备方法描述在美国专利No.3,849,550和5,800,808和PCT国际公布No.WO 00/05250中。

欧洲专利申请公布No.1 983 344 A1公开了一种胰蛋白酶消化单个多肽标准品和通过MADLDI-TOF检测其分解的方法。PCT国际公布No.WO 2008/135756公开了胰蛋白酶消化单个肽标准品，其提供了通过串联质谱分析的预期胰蛋白酶肽片段。

发明内容

与现有技术相反，本发明显示使用水解酶将复合多肽混合物标准品比如乙酸格拉默消化成多个肽片段。通过质谱法和质谱/质谱(MS/MS)分析所述肽片段。每种样品的质谱结果用作与其它样品比较的指纹。比较获得的两种样品消化物的质谱，作为相应样品的指纹。

选择第一次质谱分析仪检测的每个肽片段，进行第二次质谱分析(所谓的MS/MS分析)，以将前体肽离子切割成甚至更小的片段。通过软件比如Biotools分析从MS/MS分析获得的质谱，以获得每个肽片段的序列。结果显示在第一次质谱分析仪中检测的肽离子的组成和序列。最后，用统计学软件(比如ClinProTool)分析样品消化物的质谱，经由统计学检验(t-检验，ANOVA..)获得的单峰排序归类(比如二维峰分布)。还通过多元统计(主成分分析，PCA)获得不同样品的分型或特征。这一重要方法是统计学比较不同产品的质谱和基于得到的分类和定位位置区分样品。

附图说明

在附图中：

图1：酶消化的克帕松和共聚物-1之间的比较质谱。

图2a：由酶消化的克帕松和共聚物-1记录的离子-m/z 452.44的MS/MS谱图。

图2b：m/z 452.44的序列和碎片离子。

图3a：从酶消化的克帕松和共聚物-1记录的离子-m/z 509.385的MS/MS谱图。

图3b：m/z 509.385(1)的序列和碎片离子。

图3c：m/z 509.385(2)的序列和碎片离子。

图4a：从酶消化的克帕松和共聚物-1记录的m/z 603.515的MS/MS谱图。

图4b：m/z 603.515的序列和碎片离子。

图5a：从酶消化的克帕松和共聚物-1记录的m/z 638.590的MS/MS谱图。

图5b：m/z 638.590的序列和碎片离子。

图6a：从酶消化的克帕松和共聚物-1记录的m/z 674.880的MS/MS谱图。

图6b：m/z 674.880的序列和碎片离子。

图7a：从酶消化的克帕松和共聚物-1记录的m/z 710.622的MS/MS谱图。