[发明专利]生物法制备的环状亲和标签

权利要求书

1.用于提供包括目的多肽和环状亲和标签的蛋白物质的酶法，包括步骤：

a)提供至少一种前体蛋白物质，该前体含有所述目的蛋白和至少一种通式为X1-标签-X2的基序，其中

X1和X2表示侧链可通过能够在X1和X2残基之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶连接的氨基酸；

标签是当环化时作为亲和标签的氨基酸序列，所述亲和标签可将蛋白物质捕获到该标签的特异性结合配偶体上；

且其中所述基序N端带有羊毛硫抗生素前导序列；

b)使该前体与至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶接触，从而引入含有标签序列的分子内环状结构；以及

c)分离所得的环化的蛋白物质。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目的多肽在N-或C-端融合有至少一种通式为X1-标签-X2的基序。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述蛋白物质在所述目的多肽和至少一种基序之间含有一个裂解位点，优选其中裂解位点是因子X或Glu-C裂解位点。

4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤c)之后，在裂解位点处裂解所述环化的蛋白物质，释放目的多肽。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白物质为目的多肽，其中目的多肽一部分被至少一种基序取代，使得该基序是所述目的多肽不可分割的一部分。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中X1选自：Dhb、Dha、Thr和Ser，且其中X2是Cys或Lys；或其中X1是Cys或Lys，且X2选自：Dhb、Dha、Thr和Ser。

7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤a)和b)在含有所述至少一种能在X1和X2之间形成硫醚桥的羊毛硫抗生素酶的宿主细胞中完成，所述宿主细胞提供编码所述前体蛋白物质的核酸序列。

8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中标签含有序列Arg-Gly-Asp。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中标签含有能够与解离常数小于10μM的链菌素结合的链菌素结合序列，优选其中所述链菌素结合序列选自下组：His-Pro-Gly(HPG)、His-Pro-Lys(HPK)、His-Pro-Met(HPM)、His-Pro-Gln(HPQ)和His-Pro-Gln-Phe(HPQF)，优选其中所述链菌素结合序列是His-Pro-Gln(HPQ)或His-Pro-Gln-Phe(HPQF)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中基序X1-标签-X2由选自下组的氨基酸序列组成：Dha-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Ser-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Thr-His-Pro-Gln-Phe-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dha；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Dhb；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Cys；Dhb-His-Pro-Gln-Cys；Ser-His-Pro-Gln-Cys；Thr-His-Pro-Gln-Cys；Cys-His-Pro-Gln-Dha；Cys-His-Pro-Gln-Dhb；Cys-His-Pro-Gln-Ser；Cys-His-Pro-Gln-Thr；Ser-His-Pro-Gln-Phe  -Lys；Thr-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Phe-Ser；Lys-His-Pro-Gln-Phe-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Dhb-His-Pro-Gln-Phe-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Dha；Lys-His-Pro-Gln-Dhb；Ser-His-Pro-Gln-Lys；Thr-His-Pro-Gln Lys；Lys-His-Pro-Gln-Ser；Lys-His-Pro-Gln-Thr；Dha-His-Pro-Gln-Lys；Dhb-His-Pro-Gln-Lys；Lys-His-Pro-Gln-Dha；和Lys-His-Pro-Gln-Dhb。