[发明专利]生产蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生产目的蛋白质的方法，其包括将含有基因片段和位于该基因片段两端的转座子序列的蛋白质表达载体导入悬浮性哺乳动物细胞，其中所述基因片段含有编码目的蛋白质的DNA和选择性标记基因，将插入在一对转座子序列之间的基因片段整合入该哺乳动物细胞的染色体中以获得能够表达目的蛋白质的哺乳动物细胞；和悬浮培养该哺乳动物细胞；和能够表达目的蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞。

背景技术

利用重组DNA技术生产外源蛋白质被用于各种产业，如制药业和食品业。在多数情况下，通过以下方法进行重组蛋白质的生产：将含有编码目的蛋白质的核苷酸序列的表达载体导入宿主，如大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母、昆虫细胞、植物细胞、和动物细胞，选择表达载体被整合入染色体的转化体，并进一步在适当培养条件下培养所述细胞株。

然而，为有效开发能够生产外源蛋白质的宿主，必需选择对每种目标蛋白质具有良好生产性的宿主细胞，因此在个体宿主的外源蛋白质生产技术方面要求进一步的技术创新。

与动物细胞不同，在细菌系统、如大肠杆菌、和酵母系统中，很多情况下难以实现翻译后修饰，如糖链修饰，并因此在生产具有活性的蛋白质方面产生了问题。

由于在昆虫系统中所生产的蛋白质受到翻译后修饰，如磷酸化和加入糖链，该系统具有可以表达有原始生理活性的蛋白质的优点。但是，由于分泌蛋白的糖链结构与哺乳动物源细胞的不同，当将该蛋白质应用于制药用途时，抗原性等成为问题。

此外，由于导入外源基因时在昆虫细胞系统中使用重组病毒，存在从安全角度出发要求病毒灭活和隔离的问题。

在动物细胞系统中，对于源自高等动物包括人类的蛋白质，可以用与活体内产生的蛋白质更相似的方式进行翻译后修饰，如磷酸化、加入糖链、和折叠。这样的精确翻译后修饰对于蛋白质在其重组蛋白质中再现其所具有的原始生理活性是必需的，并且用哺乳动物细胞作为宿主的蛋白质生产系统通常应用于要求这样的生理活性的药品等。

但是用哺乳动物细胞作为宿主的蛋白质表达系统通常生产性低，且在很多情况下导致导入的基因的稳定性问题。改进用哺乳动物培养细胞作为宿主的蛋白质生产性不仅在生产治疗药物、诊断剂等中很重要，而且极大地促进了它们的研究和开发。因此，迫切需要开发一种基因表达系统，其易于使利用哺乳动物培养细胞、特别是中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)作为宿主获得高生产性细胞株成为可能。

转座子是可以从染色体上的一个基因座转移到其它基因座的可转座基因元件。转座子是用于分子生物和遗传学研究的有力工具，并在昆虫或线虫(例如，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))和植物中用于诸如诱变、基因捕获和制备转基因个体的目的。但是，对于脊椎动物包括哺乳动物细胞，这样的技术的开发已延迟。

然而，近年已报道了在脊椎动物中具有活性的转座子，并且其中一些已显示出在哺乳动物细胞、如源自小鼠和人类的细胞中具有活性。典型实例包括从青鳉(鳉鱼)克隆的转座子Tol1(专利文献1)和Tol2(非专利文献1)、从存在于鲑(Onchorhynchus)鱼科基因组中的非自主转座子再构建的Sleeping Beauty(非专利文献2)、源自蛙的人工转座子Frog prince(非专利文献3)和源自昆虫的转座子piggyBac(非专利文献4)。

这些DNA转座子已经作为基因转移工具用于诱变、基因捕获、转基因个体的制备、抗药蛋白质的表达等，以向哺乳动物细胞的基因组中引入新的表现型(非专利文献5至12)。

在昆虫的情况下，研究了用源自鳞翅目(Lepidoptera)昆虫的转座子piggyBac向蚕染色体中导入外源基因以表达由所述外源基因编码的蛋白质的方法，并已公开了运用上述技术的蛋白质生产方法(专利文献2)。

但是，由于所表达的目的蛋白质的表达水平不充足并且在蚕的整个身体中产生，导致了经济问题，因为需要先进的纯化技术从含有大量污染蛋白质的体液中以高纯度形式回收所表达的外源蛋白质。

此外，用源自青鳉的转座子Tol2在哺乳动物细胞中表达与G418抗性有关的蛋白质的实例是已知的(非专利文献12)。

引用列表

专利文献

专利文献1WO2008/072540

专利文献2日本国特表2001-532188号公报

非专利文献